脂質納米顆粒，做藥物遞送的小伙伴一定不陌生！遙想當年，小 M 也是看著同門拿著儀器擠膜，做表征，來來回回……本期就給大家整理下關于脂質納米顆粒那些事兒~

01
脂質納米顆粒
LIPID NANOPARTICLES

脂質納米顆粒 (Lipid Nanoparticle，LNP) 是一種脂質類物質組成的納米粒子，具有均勻脂質核心，廣泛用于小分子和核酸藥物的遞送。

LNP 通常由可電離陽離子脂質 (Ionizable lipids)、膽固醇、PEG 脂質 (PEGylated lipids)、結構脂質 (輔助脂質) 四個部分構成，一個典型的 LNP 包含多種組分以及包載內容 (Payload)。

圖 1. 脂質納米顆粒基本組成^[1]。

表 1. 脂質納米顆粒組成、特點及應用^[1-8]。

脂質納米顆粒遞送系統的優勢：
? 低免疫原性、具有良好的生物相容性和安全性
? 穩定性強，在體內不易變形
? 核酸包封率高
? 細胞穿透性強、轉染效率高
? 內體逃逸能力強

 
02
如何制備？
HOW TO PREPARE?

脂質納米顆粒 (LNP) 的制備依賴于自組裝的能力，帶負電荷的核酸和帶正電荷的脂質之間產生靜電絡合，LNP 通過脂質組分之間的疏水作用和范德華作用相互生長。

LNP 的制備可以通過多種方式進行，例如脂質囊泡的擠出、脂質膜的再水化、納米沉淀、微流體混合，一般的制備方式是將水和脂質成分快速混合。小 M 為大家整理了高分文獻中常用的制備方案，大家可以根據自己的實驗目的進行脂質搭配比例上的調整~

具體操作 (供參考^[9])

LNP 制劑的制備 
? 天平稱取 15 mg DLin-MC3-DMA (MC3)，然后加入 200 μL 純乙醇溶解 MC3，使其濃度達到 75 mg/mL;
? 天平稱取 10 mg DSPC，然后加入 1.0 mL 純乙醇溶解，終濃度為 10 mg/mL;
? 天平稱取 10 mg 膽固醇，加入 1.0 mL 純乙醇溶解，終濃度為 10 mg/mL;
? 天平稱取 10 mg DMG-PEG，然后加入 1.0 mL 純乙醇溶解，終濃度為 10 mg/mL;
? 將 13.3 μL DLin-MC3-DMA 溶液、24.6 μL DSPC 溶液、46.4 μL  膽固醇溶液和 11.7 μL DMG-PEG 溶液，充分混合得到澄清的混合溶液 I?；旌先芤?I 每 μL 純乙醇中含有 19 μg 的總脂質。

mRNA 包載物

mRNA 應溶解在 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液 (10 mM，pH 4) 中，將上述步驟中得到的脂質混合溶液與含有 mRNA 的水性緩沖液快速混合以實現 40/1 (總脂質/mRNA，wt/wt) 的最終重量比。

注：mRNA 比例可以增加以降低潛在的脂質毒性

mRNA –LNP 的制備

有三種常用的方法可以實現混合脂質溶液和 mRNA 溶液的快速混合：移液管混合法 (小規模制備)、渦旋混合法 (中等規模制備) 和微流體混合法 (大規模制備) 。

01
移液管混合法 (小規模制備)

1. 將 16.8 μL 上面得到的混合溶液 I 加入不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中；
2. 向試管中加入 1.2 μL 乙醇，充分混勻得到混合溶液 II；
3. 取另一個不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管，加入 46 μL 檸檬酸緩沖液 (10 mM，pH 4)，向試管中加入 8 μL mRNA (1.0 mg/mL)，混合均勻;
4. 取 54 μL mRNA 緩沖液 加入步驟 2 中獲得的混合溶液 II，立刻吹打混勻 20-30s (手動混勻);
注：水：乙醇的體積比為 3:1，混合后立即吹打混勻。否則可能影響 mRNA-LNP 混合物的活性。
5. 將步驟 4 得到的溶液在室溫下孵育 15 min；
6. 使用透析管 (MWCO 3500) 在 1 x PBS 中透析上述溶液 1 h 以上，以除去乙醇和酸性緩沖液；
7. 透析后，將溶液轉至不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中，測量體積;
8. 加入 1 x PBS 溶液，使總體積達到 800 μL。
注：這步得到的溶液可以在 4℃ 短期保存。 

02
渦旋混合法 (中等規模制備)

1. 將 21 μL 上面得到的混合溶液 I 加入不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中；
2. 向試管中加入 9 μL 乙醇，充分混勻得到混合溶液 II；
3. 取另一個不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管，加入 80 μL 檸檬酸鹽緩沖液 (10 mM，pH 4)，向試管中加入10 μL mRNA (1.0 mg/mL)，混合均勻;
4. 將渦旋混合器設備設置為“ON”，速度水平設置為“1”;
5. 在渦旋混合器上以中速渦旋 mRNA 緩沖液，再移取 30 μL 混合溶液 II 快速加入渦旋溶液中，將所得混合溶液渦旋 20-30 S;
注：水：乙醇的體積比為 3:1，混合后立即吹打混勻。否則可能影響 mRNA-LNP 混合物的活
6. 將步驟 5 所得溶液在室溫下孵育 15 min;
7. 使用透析管（MWCO 3500) 在 1 x PBS 中透析上述溶液 1 h 以上，以除去乙醇和酸性緩沖液;
8. 透析后，將溶液轉至不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中，測量體積;
9. 加入 1 x PBS 溶液，使總體積達到 1000 μL。
注：這步得到的溶液可以在 4℃ 短期保存。

03
微流體混合法 (大規模制備)
具體操作方案使用儀器相關度很高，建議參考具體使用的儀器官網步驟進行。

03
LNP 的表征
Characterization of LNPs

為了確保 LNP 的質量和有效性，需要對 LNP 進行參數表征，例如尺寸、PDI、電荷、RNA EE。

? Zeta (平均直徑/粒徑): 通過動態光散射 (DLS) 檢測。
? PDI (Polydispersity index, 多分散指數) ：范圍 0-1，數值越高表示多分散性越強，數值越小表示粒度越均勻，通過動態光散射 (DLS) 檢測。
? Charge (電荷)：對于基于 RNA 的 LNP，通常優選近中性電荷，通過 ζ 電位分析儀測量。
? Morphology (形態)：通過電子顯微鏡 (TEM、Cyro-EM、SEM、AFM 等) 檢測。
? RNA EE (RNA Encapsulation Efficieney%, RNA 包封效率) ：可通過 Ribogreen 測定來測量，先測定 LNP 外的 RNA 濃度，然后使用表面活性劑溶解 LNP 來測量 LNP 內部和外部的總 RNA 濃度，計算公式如下：

圖 2. LNP 的表征參數與相關檢測儀器^[10]。

04
脂質納米顆粒的發展
DEVELOPMENT OF LIPID NANOPARTICLES

LNP 是目前臨床應用上最廣泛的核酸藥物遞送載體，目前已有近 80 種基于 LNP 為遞送載體的基因藥物進入臨床開發階段，大大加速了基因治療的發展^[10]。但是，LNP 在實際應用中仍存在許多問題，其一是因為 LNP 在經過體循環后通常在肝部富集，對其他給藥器官的靶向困難^[11]。其二是 LNP 只能作為載體參與藥物遞送，無法協同 mRNA 治療。

目前針對 LNP 體系的改良都和這兩個方向有關。包括通過對 LNP 基本四組分的改造與優化增加 mRNA 遞送效率并提高安全性，或者通過引入第五組分來改善肝外靶向遞送^[12]。

另外一種主流的優化方案是通過引入帶修飾的脂質原料，對 LNP 表面改性實現精準靶向。例如上面提到過的，使用馬來酰胺化 PEG 脂質，與蛋白\抗體相連接，實現靶向組織、器官或細胞。

后續我們會出一期推文整理不同的修飾基團在其中的作用，以及如何設計 LNP 感興趣的老師可以繼續關注~

 
參考文獻：
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[3] Kowalski PS,et al. Delivering the Messenger: Advances in Technologies for Therapeutic mRNA Delivery. Mol Ther. 2019 Apr 10;27(4):710-728.
[4] Sebastiani F, et al.Apolipoprotein E Binding Drives Structural and Compositional Rearrangement of mRNA-ContAIning Lipid Nanoparticles. ACS Nano. 2021 Apr 27;15(4):6709-6722.
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[7] Knop K,et al. Poly(ethylene glycol) in drug delivery: pros and cons as well as potential alternatives. Angew Chem Int Ed Engl. 2010 Aug 23;49(36):6288-308.
[8] Parhiz H,et al. PECAM-1 directed re-targeting of exogenous mRNA providing two orders of magnitude enhancement of vascular delivery and expression in lungs independent of apolipoprotein E-mediated uptake. J Control Release. 2018 Dec 10;291:106-115.
[9] Wang X,et al. Preparation of selective organ-targeting (SORT) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 2023 Jan;18(1):265-291.
[10] Ma Y,et al. A perspective of lipid nanoparticles for RNA delivery. Exploration (Beijing). 2024 Apr 15;4(6):20230147.
[11] Witzigmann D,et al. Lipid nanoparticle technology for therapeutic gene regulation in the liver. Adv Drug Deliv Rev. 2020;159:344-363.