PIvotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway

Subject terms: Bone cancer, Cancer microenvironment

骨肉瘤（OS）是困擾兒童和青少年最普遍的原發性骨腫瘤。在肉瘤中，與腫瘤類似，腫瘤微環境（TME），包括細胞外基質、血小板、成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓來源的炎癥細胞和信號分子等成分，已經引起了人們的關注。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是 TME 的主要成分，大致可分為 M1 和 M2表型，前者具有促炎、腫瘤抑制作用，后者具有抗炎、腫瘤支持作用。此外，包括肉瘤在內的各種 TAM 表型已被記錄，強調了它們在各種過程中的多方面作用，包括腫瘤生長、轉移促進和血管生成。TAM 衍生的細胞因子在這些過程中起著核心作用。盡管研究已報道了 IL-6 在未分化多形性肉瘤（UPS）中的重要性，但 OS 中的關鍵細胞因子仍未得到充分了解。

IL-8 在炎癥組織中誘導中性粒細胞的趨化性，并促進腫瘤細胞的增殖和血管生成。IL-8 在癌癥中是一種轉移性和預后因子，在 OS 中可能具有類似的體外和體內效應。然而，控制 TME 中 IL-8 產生的機制及其對 OS 的影響仍不清楚。

因此，日本山梨大學骨外科、熊本大學醫學研究生院細胞病理學系、日本國立癌癥研究中心等課題團隊在一項聯合研究中旨在全面闡明源自 OS 和 TAMs 之間相互作用中的 IL-8 的效應及其對 OS 生長和轉移的影響。研究成果發表于 Cell Death & Disease 期刊題為“Pivotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway”。
首先，使用免疫組織化學（IHC）比較原發性OS 患者和 OS 肺轉移性患者部位的 TAM 數量，闡明巨噬細胞在 OS 中的作用。肺轉移中巨噬細胞標志物 Iba1 和 M2 巨噬細胞/促腫瘤標志物 CD163 陽性細胞的數量和大小明顯高于原發腫瘤。這些細胞頻繁且高度共表達這兩種標志物，表明 TAMs 可能支持 OS 進展。

然后，將 OS細胞和巨噬細胞共培養以模擬 TME（圖1 D）。WST、劃痕和侵襲試驗結果顯示，源自 OS 和 THP-1 來源的巨噬細胞的共培養條件培養基（CM）促進了 OS 細胞增殖、遷移和侵襲（圖1 B-D），強調了 OS 細胞和巨噬細胞共培養產生的細胞因子對 OS 的促進作用。

圖1 共培養 CM 對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響。
（A）將單核細胞分化為巨噬細胞并將其與 OS 細胞共培養。（B）使用 Cell Counting Kit-8 檢測對經或不經共培養 CM 處理的 OS 細胞的細胞活力。（C、D）用或不用共培養 CM 處理的 OS 細胞的劃痕和侵襲測定。

接下來，使用細胞因子陣列監測細胞因子譜，研究了源自 OS 和巨噬細胞共培養 CM 促進作用的確切機制，并觀察到了幾種細胞因子（包括 CXCL5 和 MCP-1）的改變。值得注意的是，共培養 CM 中的 IL-8 水平顯著高于單獨 OS 和巨噬細胞培養物上清液中的水平（圖2 A）。

進一步研究人骨肉瘤細胞系 143B-Luc 或 SJSA-1 細胞與巨噬細胞共培養中 IL-8 的產生，發現當 OS 細胞與人或 THP-1 衍生的巨噬細胞共培養時，IL-8 的產生增加（圖2 B）。此外，將 OS-CM 添加到 THP-1 衍生的或人巨噬細胞中時增加了 IL-8 基因和蛋白質表達（圖2 C）。值得注意的是，OS 細胞本身也產生 IL-8，并且當巨噬細胞 CM 被引入 OS 細胞時，它同樣增加了 IL-8 基因和蛋白質表達，反映了巨噬細胞中添加 OS-CM 的效果（圖2 D）。此外，OS 患者的單細胞 RNA-seq 分析顯示，Iba1+ CD163+ TAMs 中的 IL-8 表達高于 Iba-1? CD163? TAMs（圖2 E-G）。這些結果表明，在 OS TME 中，TAMs 與 OS 相互作用以增強 IL-8 的產生。

為了闡明共培養 CM 中 IL-8 對 OS 細胞增殖、遷移和侵襲的影響，研究證實了 OS 細胞表達 CXCR1 和 CXCR2，它們是 IL-8 受體。此外，重組 IL-8 在促進兩種 OS 細胞類型的增殖、遷移和侵襲方面表現出相似的趨勢。使用抗-IL-8 抗體抑制共培養 CM 中的 IL-8 減弱了共培養 CM 促進的增殖、遷移和侵襲。因此，共培養 CM 中的 IL-8 在增強 OS 細胞增殖、遷移和侵襲中發揮作用。

鑒于 IL-8-FAK（粘著斑激酶）通路在癌癥中的重要性，研究人員假設該通路可能對 OS 增殖、遷移和侵襲產生類似的影響。同樣，在暴露于重組 IL-8 后，兩種 OS 細胞類型中觀察到 FAK 磷酸化。在共培養 CM 中加入抗-IL-8 抗體可顯著抑制 FAK 磷酸化。此外，使用 FAK 磷酸化抑制劑也減弱了共培養 CM 的促進作用。這些研究結果表明，共培養 CM 中的 IL-8 通過 FAK 通路增強了 OS 細胞增殖、遷移和侵襲。

圖2 骨肉瘤和巨噬細胞之間的相互作用增加了 IL-8 的產生。
（A）143B-Luc 細胞、人巨噬細胞和共培養 CM 的細胞因子陣列。（B）OS 細胞（143B-Luc、SJSA-1）和巨噬細胞（THP-1 Mφ、HMDMs）共培養過程中 IL-8 的產生。（C）IL-8 在用 OS-CM 刺激的巨噬細胞中的表達。（D）用巨噬細胞 CM 刺激的 OS 細胞中 IL-8 的表達。（E）OS 肺轉移的 UMAP 圖。（F）髓系細胞簇中 Iba1、CD163 和 IL-8 表達的 UMAP 圖。（G）Violin 圖描繪了 IL-8 在 Iba1+/- 或 CD163+/- 髓系細胞簇中的表達。

最后，通過裸鼠皮下移植OS細胞和每周3次向腫瘤旁注射共培養CM來研究IL-8在共培養CM中對原發部位的影響。在共培養 CM 組中，143B-Luc 和 SJSA-1 細胞顯著增加了腫瘤體積和重量。IHC 分析顯示，共培養 CM 組的 Ki-67 指數和磷酸化-FAK 水平高于對照組。

將抗-IL-8 抗體引入同一皮下異種移植腫瘤模型的共培養 CM 中，與對照組相比，抗-IL-8 抗體組中 143B-Luc 和 SJSA-1 細胞的腫瘤體積和重量均受到抑制。值得注意的是，抗- IL-8 抗體不會誘導小鼠體重減輕，但 Ki-67 指數和磷酸化-FAK 水平降低。

肺轉移是影響骨肉瘤患者預后的關鍵因素，因此，通過用共培養 CM 預處理 OS 細胞并將其靜脈注射到小鼠尾部，進一步研究其對肺轉移的影響（圖3 A）。14 天后，共培養 CM 組的 IVIS、肺集落計數和 Ki-67 指數均高于對照組（圖3 B-D）。通過在共培養 CM 中加入抗-IL-8 抗體可減輕共培養 CM 的轉移促進作用（圖3 E-H），表明共培養 CM 中的 IL-8 可促進體內增殖和轉移，從而突出了 IL-8 作為新治療靶點的潛力。

圖3 共培養 CM 中 IL-8 對肺轉移的影響。
（A）OS 尾靜脈注射的實驗設計。（B）注射經或不經共培養CM預處理的腫瘤后14天肺轉移的IVIS成像和定量。（C）肺切片的蘇木精和伊紅染色，有或沒有共培養 CM 和肺集落的定量。（D）有或沒有共培養 CM 的肺集落中 Ki-67 陽性細胞的免疫組織化學和 Ki-67 標記指數的定量。（E）使用抗-IL-8 抗體進行 OS 尾靜脈注射的實驗設計。（F）注射經共培養CM預處理的腫瘤后14天（含或不含IL-8抗體）肺轉移的IVIS成像和定量。（G）加或不加IL-8抗體的共培養CM肺切片蘇木精和伊紅染色及肺菌落定量。（H）聯合或不聯合IL-8抗體共培養CM肺集落Ki-67陽性細胞的免疫組化及Ki-67標記指數的定量。

總之，該研究確定了 IL-8 是由 OS 和 TAMs 之間的相互作用產生的 TME 內的細胞因子，并進一步證實了它在體外、體內和患者樣本中的重要性。研究結果還強調了 IL-8-FAK 軸是 IL-8 影響 OS 細胞的關鍵通路。考慮到腫瘤化療的發展，IL-8 成為一種有前途的新型治療靶點。

參考文獻：Tatsuno R, Ichikawa J, Komohara Y, Pan C, Kawasaki T, Enomoto A, Aoki K, Hayakawa K, Iwata S, Jubashi T, Haro H. Pivotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway. Cell Death Dis. 2024 Feb 1;15(2):108. doi: 10.1038/s41419-024-06487-y. Erratum in: Cell Death Dis. 2024 Jul 2;15(7):471. doi: 10.1038/s41419-024-06795-3. PMID: 38302407; PMCID: PMC10834992.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38302407/

Journal Impact Factor: 8.1

The ISSN (online) 2041-4889.

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