提起細(xì)胞培養(yǎng)，污染是一個(gè)沒(méi)有辦法繞過(guò)去的問(wèn)題。除了支原體污染，還有一種是大家都聽(tīng)過(guò)，都覺(jué)得自己經(jīng)歷過(guò)，但大家都說(shuō)不清是什么東西的污染，那就是所謂的“黑膠蟲(chóng)”污染。

說(shuō)到“黑膠蟲(chóng)”污染是什么，大家都說(shuō)不清，【CELLCOOK賽庫(kù)生物】整理并分析了網(wǎng)上的說(shuō)法：

“黑點(diǎn)”主要分為兩大類：一類是生物，一類是非生物。

先來(lái)看生物類

01 原蟲(chóng)

這個(gè)就是最開(kāi)始的，也是傳說(shuō)中的那個(gè)“黑膠蟲(chóng)”的來(lái)源。翻查文獻(xiàn)，的確找到兩篇中文文獻(xiàn)與此相關(guān)，具體名字為：“牛血清中新發(fā)現(xiàn)一種對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有害的微生物”[1]，發(fā)表于1988年，發(fā)表雜志為《中國(guó)畜禽傳染病》；另一篇為：“牛血清中發(fā)現(xiàn)一種對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有害的單細(xì)胞生物”[2]，發(fā)表于1991年，雜志為《中國(guó)畜牧雜志》。兩篇文獻(xiàn)可能受限于當(dāng)時(shí)的研究狀況，或者文章發(fā)表的慣例，通篇沒(méi)有方法與結(jié)果，有的只是語(yǔ)言描述，完全不清楚是如何開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)及如何得出具體的結(jié)果的。根據(jù)文章里的描述，單純的血清就能觀察到這種“膠原蟲(chóng)”，且37℃放置一個(gè)月可見(jiàn)明顯沉淀，顯示該“膠原蟲(chóng)”增殖緩慢，明顯不是細(xì)菌或真菌，常規(guī)消毒滅菌方法均耐受暗示該“原蟲(chóng)”不是生物體，而是蛋白或鈣鹽沉淀一類的顆粒物。另外，根據(jù)CNKI的搜索結(jié)果，這兩篇文獻(xiàn)均沒(méi)有被引用，也沒(méi)有找到后續(xù)研究，按現(xiàn)在網(wǎng)上找到的說(shuō)法，是當(dāng)時(shí)沒(méi)有研究經(jīng)費(fèi)，項(xiàng)目沒(méi)有繼續(xù)下去。但根據(jù)兩篇文獻(xiàn)里的描述，該“原蟲(chóng)”可以耐受高溫滅菌，紫外照射，常規(guī)消毒劑處理和輻照，絕對(duì)是水熊蟲(chóng)級(jí)別的發(fā)現(xiàn)，但30年過(guò)去，以現(xiàn)在科研經(jīng)費(fèi)的情況，竟然沒(méi)有任何的跟進(jìn)研究，這不能不說(shuō)是很可惜的，或者說(shuō)是很明智的。

02 納米細(xì)菌

這個(gè)多見(jiàn)于國(guó)外的文獻(xiàn)，名字為nanobacteria。同樣在1988年，由芬蘭科學(xué)家在細(xì)胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)。該“細(xì)菌”表面覆蓋有鈣化外殼，能耐受高溫和強(qiáng)酸。后在各種疾病中發(fā)現(xiàn)，如腎結(jié)石、膽結(jié)石、動(dòng)脈斑塊等。但后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該“細(xì)菌”不含有DNA和RNA，且其行為方式與碳酸鈣顆粒高度相似。最后被認(rèn)定為非生物體[3]。

03 支原體

支原體在光鏡下不可見(jiàn)，原則上在光鏡下觀察到的“黑點(diǎn)”不可能是支原體。但不能排除細(xì)胞感染支原體之后，細(xì)胞狀態(tài)受到影響，狀態(tài)不佳導(dǎo)致細(xì)胞碎片增多。而且隨著支原體感染程度加深，細(xì)胞狀態(tài)變得更差，碎片增多，黑點(diǎn)增多，導(dǎo)致“黑膠蟲(chóng)”感染加深的錯(cuò)覺(jué)。這種情況下，使用針對(duì)支原體的抗生素可以減輕細(xì)胞所受的影響，碎片減少，所謂“黑膠蟲(chóng)”的污染情況得到改善。

04 細(xì)菌/真菌

根據(jù)2010年發(fā)表的一篇文獻(xiàn)，作者在其細(xì)胞培養(yǎng)液中分離了里面的“黑點(diǎn)”，檢測(cè)了其中的核酸，并測(cè)序做了聚類分析，證實(shí)了其培養(yǎng)液中的黑點(diǎn)是一種無(wú)色桿菌[4]。按此推測(cè)，只要在形狀上相似而且可在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌或真菌均有可能會(huì)被當(dāng)成是所謂的“黑膠蟲(chóng)”。但細(xì)菌或真菌與細(xì)胞間是共用培養(yǎng)環(huán)境，是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，才會(huì)出現(xiàn)網(wǎng)傳的細(xì)胞狀態(tài)好，黑點(diǎn)少的現(xiàn)象。但細(xì)菌/真菌的污染一般都會(huì)快速令培養(yǎng)液變黃變渾濁，或產(chǎn)生沉淀等較明顯感染現(xiàn)象。且可通過(guò)16S/18S的檢測(cè)分辨具體感染的菌株。這時(shí)候，對(duì)應(yīng)的抗生素是可以快速有效殺滅此類污染，如前面提到的無(wú)色桿菌，作者正是使用了環(huán)丙沙星/哌拉西林對(duì)癥處理，快速消除污染。這兩種抗生素估計(jì)就是現(xiàn)在市場(chǎng)上推銷(xiāo)的所謂“黑膠蟲(chóng)清除試劑”的主要成分（可能還加入了抗真菌藥物）。但正如前面提到的，有可能不同操作者的黑點(diǎn)是不同種的細(xì)菌或真菌，上述的抗菌藥物不一定能有效殺滅，且長(zhǎng)期使用抗生素同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，細(xì)胞狀態(tài)難以恢復(fù)。

介紹完生物類，接下來(lái)介紹非生物類

01 二氧化硅顆粒

早期細(xì)胞培養(yǎng)用玻璃培養(yǎng)瓶，可能有二氧化硅顆粒，但應(yīng)該是一過(guò)性的，不會(huì)持續(xù)產(chǎn)生。且現(xiàn)在大多用塑料的一次性培養(yǎng)瓶，應(yīng)該不會(huì)再產(chǎn)生類似問(wèn)題。

02 細(xì)胞碎片

細(xì)胞在衰亡時(shí)會(huì)產(chǎn)生的凋亡小體等碎片，而當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，所產(chǎn)生的碎片也會(huì)增多。這樣會(huì)容易產(chǎn)生一種“黑點(diǎn)”增多導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差的錯(cuò)覺(jué)。相反，如此時(shí)及時(shí)換液或調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)好了，衰亡產(chǎn)生的碎片自然減少，從而產(chǎn)生了一種“黑點(diǎn)”與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)的錯(cuò)覺(jué)，從而誤斷“黑點(diǎn)”是一種污染。如果細(xì)胞只是單純的因?yàn)闆](méi)有及時(shí)換液，或者所用培養(yǎng)基不合適等單純培養(yǎng)條件導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)變化產(chǎn)生的“黑點(diǎn)”，使用抗生素是沒(méi)有作用的；但如果是支原體等污染導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)變差，使用針對(duì)性的抗生素治療，是可以使細(xì)胞狀態(tài)變好，“黑點(diǎn)”減少的。

03 鈣鹽顆粒/蛋白沉淀

血清成分復(fù)雜，含有各種的離子，蛋白。凍融的過(guò)程會(huì)讓一部分變性的蛋白在缺少伴侶蛋白的作用下無(wú)法完全復(fù)性，從而形成沉淀析出。這就是血清中“黑點(diǎn)”形成的部分原因。國(guó)外血源的質(zhì)量相對(duì)較好，且取血過(guò)程相對(duì)成熟穩(wěn)定，血清中的蛋白析出較少，“黑點(diǎn)”較國(guó)內(nèi)血清要少，這就是“國(guó)內(nèi)血清相對(duì)較臟”說(shuō)法的來(lái)源。而熱滅活的過(guò)程會(huì)促使蛋白質(zhì)變性，產(chǎn)生沉淀，形成更多的“黑點(diǎn)”。培養(yǎng)基或血清在37℃下放置，鈣離子會(huì)產(chǎn)生諸如碳酸鈣、磷酸鈣等沉淀，蛋白質(zhì)也會(huì)析出或形成沉淀，從而產(chǎn)生更多“黑點(diǎn)”，產(chǎn)生“黑點(diǎn)”增殖的假象。但這個(gè)過(guò)程相對(duì)緩慢，就會(huì)產(chǎn)生“膠原蟲(chóng)”文獻(xiàn)里出現(xiàn)的37℃放置一個(gè)月后觀察到沉淀的現(xiàn)象，而不是一周或兩周就產(chǎn)生明顯的沉淀。

以上就是網(wǎng)上能找到的說(shuō)法的綜合分析。不難發(fā)現(xiàn)，所謂的“黑點(diǎn)”，要不就是不太常見(jiàn)的細(xì)菌或者真菌污染，要不就是細(xì)胞狀態(tài)不好等情況產(chǎn)生的細(xì)胞碎片或者是蛋白和鈣鹽等的沉淀。而所謂的“黑膠蟲(chóng)”，可能是受當(dāng)時(shí)研究或觀察手段所限，或?qū)σ恍┈F(xiàn)象觀察后思考不周，沒(méi)有嚴(yán)格驗(yàn)證而所產(chǎn)生的錯(cuò)誤結(jié)論。正如這里總結(jié)的，不同的培養(yǎng)者遇到的“黑點(diǎn)”可能都是不一樣的，或污染或碎片，但就因?yàn)槎际且恍┖谏念w粒，就將其簡(jiǎn)單地歸為那虛無(wú)縹緲的“黑膠蟲(chóng)”，這是非常缺乏科學(xué)精神的行為，也非常不應(yīng)該出現(xiàn)在科研工作者身上的。相反，我們應(yīng)該對(duì)出現(xiàn)了“黑點(diǎn)”的細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)的分析，認(rèn)真找出導(dǎo)致“黑點(diǎn)”產(chǎn)生的真正原因。才能真正的解決“黑點(diǎn)”的問(wèn)題，減少“黑點(diǎn)”出現(xiàn)的頻率。

這里，我們給出一點(diǎn)思路：
“黑點(diǎn)”的出現(xiàn)是系統(tǒng)性的還是只是在個(gè)別細(xì)胞身上？如果是前者，考慮是否共用的試劑出現(xiàn)污染還是品質(zhì)出現(xiàn)問(wèn)題；如果是后者，則考慮細(xì)胞的培養(yǎng)條件是否合適，或者是否污染。
而對(duì)于疑似的污染，可嘗試富集“黑點(diǎn)”后提取DNA，擴(kuò)增16S或18S基因并測(cè)序，比對(duì)后確認(rèn)污染的是什么菌，并對(duì)癥治療。而不是隨便在外面買(mǎi)個(gè)所謂的“黑膠蟲(chóng)清除試劑”一通亂加，這才是對(duì)細(xì)胞最好的處理。

以上，在“黑點(diǎn)”出現(xiàn)的時(shí)候，你真的了解你的細(xì)胞經(jīng)歷了什么了嗎？