甲狀腺未分化癌（Anaplastic Thyroid Cancer, ATC）是一種極具侵襲性的甲狀腺癌，通常在初診時(shí)就已出現(xiàn)局部晚期浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。因此，系統(tǒng)化療和靶向治療對(duì)于改善ATC患者的預(yù)后至關(guān)重要。然而，ATC對(duì)傳統(tǒng)治療表現(xiàn)出顯著的耐藥性，這使得研究其耐藥機(jī)制并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，RNA修飾（尤其是m⁵C修飾）在腫瘤發(fā)生和耐藥性中的作用逐漸受到關(guān)注，但其在ATC中的具體機(jī)制尚不清楚。
 
近日，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院鄭向前教授團(tuán)隊(duì)以甲狀腺未分化癌（ATC）為研究對(duì)象，利用m⁵C MeRIP-seq等技術(shù)揭示了NSUN2介導(dǎo)的m⁵C修飾在ATC耐藥性中的作用機(jī)制，闡明了NSUN2/SRSF6/UAP1信號(hào)軸在ATC多藥耐藥性（Multidrug Resistance, MDR）中的關(guān)鍵作用，并提出通過小分子NSUN2抑制劑克服耐藥性的新策略。這一發(fā)現(xiàn)不僅為ATC的治療提供了新的靶點(diǎn)，也為理解RNA修飾在腫瘤耐藥性中的作用提供了重要依據(jù)。相關(guān)研究成果以《NSUN2-mediated m⁵C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis》為題發(fā)表于《Theranostics》雜志。
 
標(biāo)題：NSUN2-mediated m⁵C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis（NSUN2介導(dǎo)的m⁵C修飾通過NSUN2/SRSF6/UAP1信號(hào)軸驅(qū)動(dòng)可變剪切重編程并促進(jìn)甲狀腺未分化癌的多藥耐藥性）
發(fā)表時(shí)間：2025-1-27
發(fā)表期刊：Theranostics
影響因子：IF 12.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、scRNA-seq、bulk RNA-seq（易基因金牌技術(shù)）
 
本研究通過對(duì)ATC樣本的bulk轉(zhuǎn)錄組（bulk RNA-seq）和單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析，以篩選與多藥耐藥性（MDR）相關(guān)的m⁵C修飾基因。隨后進(jìn)行IC50實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)分析，并利用Nsun2基因敲除的自發(fā)性甲狀腺癌（spontaneous tumorigenic ATC）小鼠模型，證明了NSUN2在ATC中促進(jìn)MDR的作用。為了探究NSUN2介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，研究構(gòu)建了NSUN2基因敲除的ATC細(xì)胞系，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和MeRIP-seq分析。此外還通過RNA-seq測序和可變剪切(alternative splicing，AS)分析，研究NSUN2敲除后的整體變化。進(jìn)一步通過糖蛋白染色、變性免疫沉淀泛素化、核質(zhì)分離和PCR等方法，探討了NSUN2/SRSF6/UAP1軸的潛在機(jī)制。最后在體外和體內(nèi)評(píng)估了小分子NSUN2抑制劑與抗癌藥物的協(xié)同效應(yīng)。
研究結(jié)果表明，NSUN2表達(dá)與ATC中的MDR顯著相關(guān)。NSUN2作為m⁵C的“writer”，ALYREF作為“reader”，它們共同作用于SRSF6 mRNA，誘導(dǎo)可變剪切重編程，并將UAP1基因的剪接形式從AGX1轉(zhuǎn)向AGX2。結(jié)果表明，AGX2增強(qiáng)了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的N-糖基化，通過抑制泛素化介導(dǎo)的降解以穩(wěn)定這些蛋白。NSUN2抑制劑通過降低NSUN2酶活性并減少下游靶標(biāo)表達(dá)，為克服ATC中的MDR提供了一種新的、有前景的治療策略。

本研究揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號(hào)軸在ATC的MDR中的關(guān)鍵作用，并確定了NSUN2作為化療和靶向治療的協(xié)同靶點(diǎn)。
  研究摘要  
研究方法
生物信息學(xué)分析：通過分析ATC樣本的bulk RNA-seq測序數(shù)據(jù)，篩選與MDR相關(guān)的m⁵C修飾基因。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子機(jī)制研究：利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建NSUN2基因敲除（knockout）的ATC細(xì)胞系，通過RNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和MeRIP-seq分析等技術(shù)研究NSUN2的功能。
動(dòng)物模型：構(gòu)建Nsun2基因敲除的自發(fā)性甲狀腺癌小鼠模型，評(píng)估NSUN2體內(nèi)對(duì)MDR影響。
藥物敏感性分析：通過IC50實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測NSUN2抑制劑與抗癌藥物的聯(lián)合效應(yīng)。
 
研究結(jié)果
（1）生物信息學(xué)分析揭示ATC中NSUN2和多藥耐藥性（MDR）之間的相關(guān)性
通過分析Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）數(shù)據(jù)庫中的藥物敏感性數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)NSUN2的表達(dá)與多種抗癌藥物（包括化療藥物和酪氨酸激酶抑制劑）的IC50值呈正相關(guān)。
利用GEO數(shù)據(jù)庫中的ATC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將患者分為高NSUN2表達(dá)組和低NSUN2表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)高NSUN2表達(dá)與細(xì)胞分裂、有絲分裂、細(xì)胞周期等化療靶向過程相關(guān)。
scRNA-seq測序分析顯示，NSUN2在ATC細(xì)胞中的表達(dá)與多種化療藥物和TKI的耐藥性相關(guān)。
 
圖1：生物信息學(xué)分析揭示NSUN2與ATC中多藥耐藥性（MDR）的相關(guān)性。
  A）來自CTRP數(shù)據(jù)庫的ATC患者基因表達(dá)與藥物敏感性的Spearman相關(guān)性分析。
B-C）高NSUN2表達(dá)組與低NSUN2表達(dá)組之間差異表達(dá)基因（DEGs）的富集通路總結(jié)。
D）ATC的scRNA-seq數(shù)據(jù)的tSNE圖，展示了鑒定出的細(xì)胞clusters（n=10）。
E）散點(diǎn)圖顯示NSUN2陽性細(xì)胞與NSUN2陰性細(xì)胞的log2倍變化（log2FC）及其與每種藥物預(yù)測的IC50曲線下面積（AUC）值的相關(guān)性。
F）蝴蝶圖展示NSUN2表達(dá)、藥物敏感性與基因本體（GO）通路分析之間的相關(guān)性。
G）ATC的scRNA-seq數(shù)據(jù)的tSNE圖，展示了鑒定出的細(xì)胞clusters（n=10）。
H）使用Beyondcell對(duì)GEO數(shù)據(jù)集樣本進(jìn)行的單細(xì)胞藥物敏感性分析。
I）NSUN2表達(dá)與Beyondcell評(píng)分之間的相關(guān)性。
 
（2）ATC中NSUN2誘導(dǎo)的MDR取決于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性
在ATC細(xì)胞系中敲低或敲除NSUN2后，細(xì)胞對(duì)多種藥物的敏感性顯著增加，表明NSUN2表達(dá)與MDR密切相關(guān)。
通過構(gòu)建NSUN2催化活性突變體（C271A），發(fā)現(xiàn)只有野生型NSUN2能夠恢復(fù)m⁵C修飾活性和藥物耐受性，表明NSUN2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性是其誘導(dǎo)MDR的關(guān)鍵。
  圖2：ATC中由NSUN2誘導(dǎo)的MDR依賴于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
  A）通過Western blot分析檢測Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后的NSUN2蛋白表達(dá)情況。
B）通過點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測NSUN2基因敲除對(duì)Cal-62細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄組中m⁵C水平的影響。
C）通過比色法m⁵C定量實(shí)驗(yàn)確認(rèn)NSUN2基因敲除后Cal-62細(xì)胞中m⁵C水平的變化。
D-F）通過細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)估NSUN2基因敲除對(duì)Cal-62細(xì)胞對(duì)多柔比星（doxorubicin）、順鉑（cisplatin）和侖伐替尼（lenvatinib）敏感性的影響。
G）通過Western blot分析檢測Cal-62細(xì)胞經(jīng)不同處理后NSUN2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
H）通過點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)載體處理后Cal-62細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄組中m⁵C豐度。
I）通過比色法m⁵C定量實(shí)驗(yàn)確認(rèn)經(jīng)處理后Cal-62細(xì)胞中m⁵C水平變化。
J-L）通過細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)估經(jīng)不同載體轉(zhuǎn)染的Cal-62細(xì)胞的IC50值。
M）自發(fā)性ATC小鼠模型的構(gòu)建方案，包括靶向策略（左）和繁殖方案（右）。
N）小鼠基因分型結(jié)果，其中TPO-cre的DNA凝膠條帶大小為130/324bp，BrafV600E為185/307bp，Trp53flox/flox為290/370bp，Nsun2flox/flox為151/212bp。
O）在基因工程小鼠中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案。mATC（小鼠甲狀腺未分化癌）。
P）散點(diǎn)圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
Q）散點(diǎn)圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
R）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
 
（3）在ATC中，NSUN2介導(dǎo)的m⁵C修飾通過靶向SRSF6驅(qū)動(dòng)可變剪切重編程
蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，NSUN2敲除后，與RNA剪接相關(guān)的蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中SRSF6蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而其mRNA水平不變。
MeRIP-seq和qPCR結(jié)果表明，NSUN2通過m⁵C修飾調(diào)節(jié)SRSF6 mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響其蛋白表達(dá)。
通過突變SRSF6 mRNA上的m⁵C修飾位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)對(duì)SRSF6的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要。
  圖3：ATC中，NSUN2介導(dǎo)的m⁵C修飾通過靶向SRSF6驅(qū)動(dòng)可變剪切重編程。
  A）通過TMT-MS檢測的Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后蛋白水平變化的火山圖。
B）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數(shù)據(jù)的GO富集分析。
C）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后差異剪接基因的百分比剪接包含（ΔPSI）的火山圖。
D）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后顯著ΔPSI變化的小提琴圖。
E）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后SF3A/B、U2AF核心復(fù)合體和hnRNP家族中DEG熱圖。
F）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數(shù)據(jù)中SRSF6蛋白水平的統(tǒng)計(jì)分析。
G）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后指示蛋白的Western blot分析。
H）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后SRSF6基因座周圍的MeRIP-seq數(shù)據(jù)的IGV軌跡圖。
I）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后SRSF6 mRNA中m⁵C富集的MeRIP-qPCR檢測。
J）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA中m⁵C富集的MeRIP-qPCR分析。
K）NSUN2基因敲除后Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布qRT-PCR分析。
L）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
M）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白的Western blot分析。
N）SRSF6中的典型m⁵C結(jié)合位點(diǎn)。頂部為m⁵C結(jié)合位點(diǎn)的motif序列；底部為SRSF6中鑒定的m⁵C位點(diǎn)。
O）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA中m⁵C富集的MeRIP-qPCR定量。
P）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
 
（4）NSUN2通過增強(qiáng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的N-糖基化促進(jìn)ATC中的MDR
轉(zhuǎn)錄組分析和KEGG通路分析顯示，NSUN2參與N-糖鏈生物合成過程。
通過糖蛋白染色和蛋白質(zhì)印跡分析，發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCC1和ABCG2）的N-糖基化水平降低，蛋白穩(wěn)定性下降。

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，NSUN2敲除細(xì)胞對(duì)藥物攝取增加，表明藥物外排減少，耐藥性降低。
  圖4：NSUN2通過增強(qiáng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的N-糖基化促進(jìn)ATC中的MDR。
  A）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的GO富集分析。
B-C）Cal-62細(xì)胞中NSUN2基因敲除后轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的基因集富集分析（GSEA）。
D）總蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色（左），NSUN2基因敲除后Cal-62細(xì)胞的糖蛋白染色結(jié)果（右）。
E-F）經(jīng)或未經(jīng)TM（tunicamycin）、SS（swAInsonine）處理的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白水平的Western blot分析。細(xì)胞裂解樣本經(jīng)或未經(jīng)PNGase F處理。“G”表示N-糖基化，“DG”表示N-糖基化減少。
G）NSUN2基因敲除的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）代表性免疫組化（IHC）圖像顯示35例ATC組織中NSUN2、ABCG2和ABCC1的表達(dá)情況。
I-J）采用卡方檢驗(yàn)分析NSUN2與ABCG2或ABCC1表達(dá)之間的相關(guān)性。
K-L）NSUN2與ABCG2或ABCC1的IHC評(píng)分的相關(guān)性分析。
M-N）使用NetNglyc服務(wù)器預(yù)測的ABCG2和ABCC1的潛在N-糖基化天冬酰胺位點(diǎn)。
O-P）分別在轉(zhuǎn)染了N557Q、N388Q、N596Q或N71Q、N19Q、N310Q、N(71+310)Q突變質(zhì)粒的Cal-62細(xì)胞中，通過Western blot檢測ABCG2和ABCC1的表達(dá)情況。
Q-S）NSUN2基因敲除后Cal-62細(xì)胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細(xì)胞內(nèi)積累情況的流式細(xì)胞儀分析。右側(cè)顯示平均熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果。
 
（5）NSUN2通過N-糖基化增強(qiáng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的穩(wěn)定性
通過western blot 分析和泛素化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后，ABCC1和ABCG2的泛素化水平增加，表明N-糖基化缺失導(dǎo)致這些蛋白更容易被降解。
使用蛋白酶體抑制劑MG132可以部分恢復(fù)ABCC1和ABCG2的蛋白水平，進(jìn)一步證實(shí)了N-糖基化對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響。
  圖5：NSUN2通過N-糖基化增強(qiáng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的穩(wěn)定性。
  A）Cal-62細(xì)胞經(jīng)TM或不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進(jìn)行Western blot分析。
B）NSUN2基因敲除的Cal-62細(xì)胞經(jīng)不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進(jìn)行Western blot分析。
C）經(jīng)TM和MG132處理的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
D）使用ImageJ軟件對(duì)ABCC1和ABCG2蛋白水平進(jìn)行定量分析。
E-F）經(jīng)TM和MG132處理的Cal-62細(xì)胞進(jìn)行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進(jìn)行Western blot分析。
G）NSUN2基因敲除且經(jīng)MG132處理的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）使用ImageJ軟件對(duì)ABCC1和ABCG2蛋白強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。
I-J）NSUN2基因敲除且經(jīng)MG132處理的Cal-62細(xì)胞進(jìn)行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進(jìn)行Western blot分析。
K-L）在Cal-62細(xì)胞中表達(dá)的野生型（WT）或指示的ABCG2/ABCC1突變體經(jīng)125μg/mL環(huán)己酰亞胺（CHX）處理特定時(shí)間間隔后，通過Western blot進(jìn)行分析。
M-N）使用ImageJ軟件對(duì)ABCG2或ABCC1的蛋白強(qiáng)度定量分析，并以β-Actin水平歸一化。
 
（6）NSUN2通過介導(dǎo)UAP1到SRSF6的可變剪切來促進(jìn)N-糖基化
UAP1是N-糖基化反應(yīng)中UDP-GlcNAc合成的關(guān)鍵酶，其有兩種亞型（AGX1和AGX2）。
NSUN2敲除后，UAP1的剪接形式從AGX2轉(zhuǎn)變?yōu)锳GX1，導(dǎo)致N-糖基化活性降低。
通過過表達(dá)SRSF6，可以逆轉(zhuǎn)這一剪接變化，恢復(fù)N-糖基化水平和藥物耐受性。
  圖6：NSUN2通過SRSF6介導(dǎo)UAP1的可變剪切促進(jìn)N-糖基化。
  A）UAP1促進(jìn)UDP-GlcNAc的生物合成，UDP-GlcNAc是糖基化反應(yīng)中的關(guān)鍵供體，尤其在N-糖基化和O-GlcNAc修飾中。
B）Sashimi圖顯示NSUN2基因敲除后Cal-62細(xì)胞中UAP1剪切事件的變化。
C）對(duì)照組與NSUN2基因敲除的Cal-62細(xì)胞中UAP1剪切的RT-PCR分析。
D）自發(fā)性小鼠ATC腫瘤中UAP1的剪切事件的RT-PCR，有或沒有Nsun2基因敲除。
E）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中UAP1剪切事件的RT-PCR（上圖）。Western blot分析了SRSF6重建（下圖）。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色（左）。經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞糖蛋白染色（右）。
G）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H-J）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細(xì)胞內(nèi)積累情況的流式細(xì)胞儀分析。右側(cè)顯示了平均熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果。
K-M）指示載體處理Cal-62細(xì)胞對(duì)多柔比星、順鉑和侖伐替尼敏感影響細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)。
N-P）指示載體處理Cal-62細(xì)胞對(duì)多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)影響的腫瘤生長曲線。
Q-S）指示載體處理Cal-62細(xì)胞對(duì)多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)影響腫瘤最終重量。
 
（7）作為m⁵C的“reader”， ALYREF可以鑒定SRSF6并將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)
通過RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ALYREF能夠直接結(jié)合m⁵C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。
ALYREF的K171A突變體顯著降低對(duì)m⁵C -SRSF6結(jié)合能力，表明ALYREF是m⁵C修飾的“reader”。
ALYREF敲低或過表達(dá)可以調(diào)控SRSF6的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響藥物耐受性。 圖7：ALYREF作為m⁵C “reader”，能夠鑒定并介導(dǎo)SRSF6從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
  A-B）GSEA分析表明ALYREF的表達(dá)與化療耐藥性相關(guān)。
C）熱圖顯示在NSUN2基因敲除或ALYREF、YBX1和SRSF2基因敲低的Cal-62細(xì)胞中與多柔比星和順鉑耐藥性相關(guān)的基因。
D）通過RIP-qPCR檢測ALYREF與Cal-62細(xì)胞中SRSF6的結(jié)合。
E）通過Western blot分析從SRSF6（m⁵C）下拉實(shí)驗(yàn)中獲得的指示蛋白。
F）通過RIP-qPCR比較在經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中，野生型ALYREF（ALYREF-WT）和K171A突變型ALYREF（ALYREF-K171A）與SRSF6的結(jié)合。
G）通過RIP-qPCR評(píng)估NSUN2基因敲除后Cal-62細(xì)胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結(jié)合。
H）通過RIP-qPCR評(píng)估經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結(jié)合。
I）通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)評(píng)估ALYREF基因敲低的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
J）在過表達(dá)ALYREF或ALYREF-K171A突變體的Cal-62細(xì)胞中，SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
K）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
L-N）細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)估指示載體處理對(duì)Cal-62細(xì)胞對(duì)多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)的影響。
O）通過Western blot分析經(jīng)指示載體處理的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白的水平。
P）NSUN2基因敲除的Cal-62細(xì)胞中ALYREF的免疫熒光染色（左側(cè)）以及核/質(zhì)ALYREF分布的定量分析（右側(cè)）。
Q）通過Western blot分析（左側(cè)）以及相應(yīng)的定量分析（右側(cè)），展示對(duì)照組和NSUN2基因敲除的Cal-62細(xì)胞中核和質(zhì)ALYREF的水平，PARP1和TUBULIN分別作為核和質(zhì)標(biāo)記。
 
（8）小分子NSUN2抑制劑增強(qiáng)ATC中多藥敏感性
設(shè)計(jì)并合成小分子NSUN2抑制劑（NSUN2i），能夠顯著降低ATC細(xì)胞中的m⁵C水平。
NSUN2i處理后，SRSF6的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，UAP1剪接形式改變，N-糖基化水平降低，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穩(wěn)定性下降。
體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)均顯示，NSUN2i與化療藥物或TKI聯(lián)合使用可以顯著增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果。
  圖8：小分子NSUN2抑制劑增強(qiáng)ATC對(duì)多藥的敏感性。
  A）通過點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)評(píng)估NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞中mRNA的m⁵C水平。
B）基于RT-qPCR的MeRIP檢測NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA的m⁵C富集分析。
C）通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)評(píng)估NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
D）通過Western blot分析NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞中指示蛋白的水平。
E）RT-PCR顯示經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞和ACT-1細(xì)胞中UAP1的剪接事件。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色（左），經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞和ACT-1細(xì)胞的糖蛋白染色（右）。
G）通過Western blot分析經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞和ACT-1細(xì)胞中指示蛋白的水平。
H-J）通過流式細(xì)胞儀分析經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細(xì)胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細(xì)胞內(nèi)積累情況。右側(cè)顯示平均熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果。
K-M）細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)估NSUN2抑制劑與多柔比星、順鉑或侖伐替尼聯(lián)合使用對(duì)Cal-62細(xì)胞的影響。
N）展示在基因工程小鼠中NSUN2抑制劑、多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案示意圖。
O）散點(diǎn)圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
P）散點(diǎn)圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
Q）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
  圖9：NSUN2在ATC多藥耐藥中的功能和機(jī)制示意圖模型。  
討論和局限性
本研究揭示了NSUN2通過m⁵C修飾調(diào)節(jié)SRSF6的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響UAP1剪切和N-糖基化水平，最終導(dǎo)致ATC耐藥性的機(jī)制。研究結(jié)果表明，NSUN2及其下游靶點(diǎn)是靶向ATC耐藥性的潛在治療靶點(diǎn)。
然而，NSUN2在正常細(xì)胞生理中也發(fā)揮重要作用，系統(tǒng)性抑制NSUN2可能會(huì)帶來安全性問題。此外，如何實(shí)現(xiàn)NSUN2抑制劑的腫瘤特異性遞送仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
 
易小結(jié)
本研究通過m⁵C MeRIP-seq和RNA-seq等分析揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號(hào)軸在ATC耐藥性中的作用機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供了理論依據(jù)。NSUN2抑制劑與現(xiàn)有抗癌藥物的聯(lián)合使用有望成為克服ATC耐藥性的新方法。未來的研究需要進(jìn)一步評(píng)估NSUN2抑制劑的安全性和有效性，并探索其在其他腫瘤類型中的潛在應(yīng)用。

m⁵C MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究的m⁵C MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）主要用于揭示NSUN2在甲狀腺未分化癌（ATC）中的作用機(jī)制，主要表現(xiàn)在：
（1）鑒定m⁵C修飾的靶基因：通過MeRIP-seq技術(shù)能夠系統(tǒng)地分析NSUN2在ATC細(xì)胞中對(duì)mRNA的m⁵C修飾情況。研究發(fā)現(xiàn)，NSUN2能夠特異性地修飾SRSF6 mRNA上的m⁵C位點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究NSUN2如何通過m⁵C修飾調(diào)控基因表達(dá)提供了直接證據(jù)。
（2）揭示m⁵C修飾的功能：MeRIP-seq分析顯示，NSUN2介導(dǎo)的m⁵C修飾能夠調(diào)節(jié)SRSF6 mRNA的細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。具體來說，m⁵C修飾增強(qiáng)了SRSF6 mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)了SRSF6蛋白的表達(dá)。這一過程對(duì)于ATC細(xì)胞的多藥耐藥性（MDR）至關(guān)重要。
（3）探索m⁵C修飾的調(diào)控機(jī)制：研究中通過MeRIP-seq結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)手段（如RNA下拉實(shí)驗(yàn)和RIP-qPCR），揭示了ALYREF作為m⁵C修飾的“reader”，能夠鑒定并結(jié)合m⁵C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步完善了m⁵C修飾在基因表達(dá)調(diào)控中的分子機(jī)制。
（4）驗(yàn)證m⁵C修飾的生物學(xué)意義：通過比較NSUN2敲除細(xì)胞與野生型細(xì)胞的MeRIP-seq數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后SRSF6 mRNA的m⁵C修飾水平顯著下降，同時(shí)SRSF6蛋白表達(dá)也受到抑制。這表明m⁵C修飾在維持SRSF6功能和ATC細(xì)胞耐藥性中發(fā)揮著重要作用。

參考文獻(xiàn)：
Hou X, Dong Q, Hao J, Liu M, Ning J, Tao M, Wang Z, Guo F, Huang D, Shi X, Gao M, Li D, Zheng X. NSUN2-mediated m⁵C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis. Theranostics 2025; 15(7):2757-2777. doi:10.7150/thno.104713.