腸道菌群-表觀遺傳：解碼腸道疾病發(fā)生新機(jī)制研究
炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）主要包括克羅恩病（Crohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），是一組影響胃腸道的慢性炎癥性疾病，其特征是持續(xù)的免疫激活、黏膜炎癥和組織損傷。腸道上皮細(xì)胞和黏膜屏障的完整性對(duì)于維持腸道屏障和結(jié)腸穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。表觀遺傳調(diào)控（包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA和染色質(zhì)互作）對(duì)調(diào)控胃腸道發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中的基因表達(dá)變化至關(guān)重要。NSD2（也稱為WHSC1或MMSET）是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，專門(mén)負(fù)責(zé)在組蛋白H3的賴氨酸36位點(diǎn)進(jìn)行二甲基化（H3K36me2），與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。有研究表明，NSD2在IBD患者的腸上皮細(xì)胞（intestinal ePIthelial cells，IECs）和IBD小鼠模型中的表達(dá)均降低。然而，NSD2在IBD中的確切作用仍不清楚。
 
近日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院徐悅和上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院肖秀英為共同第一作者，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院李力研究員和高維強(qiáng)教授為共同通訊，利用ChIP-seq等技術(shù)探討了腸上皮細(xì)胞（IECs）中的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶NSD2如何通過(guò)維持含黃素單加氧酶（flavin-contAIning monooxygenase，F(xiàn)MO）介導(dǎo)的牛磺酸（Taurine）生物合成來(lái)預(yù)防腸道屏障破壞，尤其是在炎癥性腸病（IBD）中的調(diào)控機(jī)制。研究揭示了NSD2在腸道炎癥中的重要作用，并提出了NSD2-H3K36me2介導(dǎo)的牛磺酸生物合成在維持腸道黏膜屏障穩(wěn)態(tài)中的重要性。相關(guān)研究成果以《Epithelial NSD2 maintains FMO-mediated taurine biosynthesis to prevent intestinal barrier disruption》為題發(fā)表于《Clinical and Translational Medicine》（CTM）期刊。
 
標(biāo)題：Epithelial NSD2 maintains FMO-mediated taurine biosynthesis to prevent intestinal barrier disruption（上皮細(xì)胞NSD2維持FMO介導(dǎo)的牛磺酸生物合成以預(yù)防腸道屏障破壞） 發(fā)表時(shí)間：2024年12月10日
發(fā)表期刊：Clin Transl Med（CTM）
影響因子：IF7.9/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、RNA-seq等
 
本研究以IBD小鼠的結(jié)腸組織、SW620細(xì)胞和MC38細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)分析IBD患者的臨床數(shù)據(jù)庫(kù)，研究NSD2表達(dá)在IBD發(fā)生中的變化。通過(guò)生成NSD2基因敲除小鼠進(jìn)一步探究NSD2在IBD中的作用。分離IECs后進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）以鑒定導(dǎo)致小鼠IBD的分子信號(hào)通路和關(guān)鍵分子。通過(guò)分子和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析并驗(yàn)證NSD2在IBD發(fā)展中的作用。并通過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NSD2在IBD發(fā)展中的分子機(jī)制。

研究結(jié)果揭示了小鼠IECs中NSD2缺失促進(jìn)了IBD中的上皮屏障破壞和炎癥反應(yīng)。從機(jī)制上講，NSD2缺失導(dǎo)致H3K36me2和黃素單加氧酶（FMO，牛磺酸合成酶）mRNA下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致IECs中牛磺酸生物合成減少。而牛磺酸補(bǔ)充可以顯著緩解由NSD2缺失引起的IBD癥狀。
本研究數(shù)據(jù)表明，NSD2在維持FMO介導(dǎo)的牛磺酸生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以預(yù)防腸道炎癥。同時(shí)，本研究結(jié)果揭示了NSD2-H3K36me2介導(dǎo)的牛磺酸生物合成在維持腸道黏膜屏障穩(wěn)態(tài)中的重要調(diào)控機(jī)制。

研究關(guān)鍵要點(diǎn)
本研究探討了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶NSD2在通過(guò)維持牛磺酸生物合成以預(yù)防腸道屏障破壞中的作用。在人類(lèi)樣本和IBD小鼠模型中，NSD2水平均有所降低。研究證明了NSD2缺失抑制了腸道細(xì)胞中牛磺酸合成過(guò)程，從而導(dǎo)致腸道炎癥加劇。牛磺酸的補(bǔ)充顯著緩解了由NSD2缺失引起的癥狀。這些數(shù)據(jù)表明，維持NSD2介導(dǎo)的牛磺酸生物合成對(duì)于保護(hù)腸道屏障和減輕炎癥至關(guān)重要。
 
圖形摘要：NSD2介導(dǎo)FMO在腸道牛磺酸積累中維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制示意圖

• 小鼠腸上皮細(xì)胞（IECs）中NSD2缺失加劇了IBD中的上皮屏障破壞和炎癥反應(yīng)。
• NSD2缺失導(dǎo)致H3K36me2和FMO（牛磺酸合成酶）mRNA下調(diào)，從而導(dǎo)致IECs中牛磺酸生物合成減少。
• 牛磺酸的補(bǔ)充顯著減輕了由NSD2缺失引起的IBD癥狀。

 
研究方法
臨床樣本分析：通過(guò)分析IBD患者的結(jié)腸組織樣本，評(píng)估NSD2的表達(dá)水平。
基因敲除小鼠模型：通過(guò)生成NSD2基因敲除（Nsd2^Vil-KO）小鼠，研究NSD2缺失對(duì)IBD的功能影響。
RNA-seq和ChIP-seq：鑒定NSD2缺失導(dǎo)致的分子信號(hào)通路和關(guān)鍵分子變化。
細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)：分析NSD2在IBD發(fā)展中的作用。
拯救實(shí)驗(yàn)：通過(guò)補(bǔ)充牛磺酸來(lái)確認(rèn)NSD2在IBD發(fā)展中的分子機(jī)制。
 
結(jié)果圖形
（1）IBD中NSD2表達(dá)降低
研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，IBD患者的結(jié)腸組織中NSD2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低。在DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠模型中，NSD2和H3K36me2的表達(dá)也降低，表明NSD2表達(dá)與IBD發(fā)病機(jī)制之間存在潛在聯(lián)系。
  圖1：IBD中NSD2表達(dá)降低。
  (A) 健康對(duì)照組、潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩病（CD）樣本中NSD2 mRNA的箱線圖（GSE137344和GSE57945數(shù)據(jù)集）。
(B) 左側(cè)為NSD2染色圖像，右側(cè)為正常和IBD活檢中上皮NSD2表達(dá)的定量分析。
(C) 用于誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎的葡聚糖硫酸鈉（DSS）方案的示意圖。
(D) RT-qPCR分析對(duì)照組和DSS處理的野生型小鼠IECs中NSD2 mRNA表達(dá)（每組n=5）。
(E) 對(duì)照組和DSS處理的野生型小鼠中NSD2表達(dá)的免疫組化分析。
(F) 對(duì)照組和DSS處理的野生型小鼠中NSD2表達(dá)的免疫印跡分析。
(D-F) 所有樣本均來(lái)自8周齡的野生型小鼠，分別接受或未接受DSS處理。
 
（2）IECs中NSD2缺失加劇腸道炎癥反應(yīng)
通過(guò)基因編輯小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)NSD2缺失的小鼠在DSS誘導(dǎo)的IBD中表現(xiàn)出更嚴(yán)重的癥狀，包括加速的體重下降、更明顯的結(jié)腸縮短和脾臟腫大。組織學(xué)檢查顯示，NSD2缺失的小鼠結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腺窩侵蝕更嚴(yán)重，組織學(xué)評(píng)分更高。
 
圖2：IECs中NSD2缺失加劇腸道炎癥反應(yīng)。
  (A-B) Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠IECs中NSD2和H3K36me2表達(dá)的免疫組化（A）和免疫印跡（B）分析（每組n=5）。
(C) 用于誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎的葡聚糖硫酸鈉（DSS）方案的示意圖。
(D) 小鼠被喂食2% DSS溶液以誘導(dǎo)結(jié)腸炎，并記錄體重下降（n=4）。
(E) DSS處理后Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠結(jié)腸的代表性圖像。
(F) 小鼠被處死時(shí)（第10天）脾臟重量與體重的比值。
(G) 2% DSS處理的Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠第10天收集的結(jié)腸組織的H&E染色切片及組織學(xué)評(píng)分的定量分析。
(H) DSS處理后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠結(jié)腸固有層細(xì)胞（n=3）。
(I) 通過(guò)RT-qPCR分析Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠整個(gè)結(jié)腸中炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的相對(duì)mRNA表達(dá)水平（n=3）。
(J) 2% DSS處理小鼠的腸道黏液素2（黏液細(xì)胞）、阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫（AB-PAS；黏液細(xì)胞）和溶菌酶（Lys；潘氏細(xì)胞）染色及定量結(jié)果（n=3）。
 
（3）上皮NSD2缺失加劇屏障功能障礙和細(xì)胞凋亡
研究發(fā)現(xiàn)，NSD2缺失的小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白（ZO-1和E-cadherin）表達(dá)減少，腸道通透性增加，表明NSD2對(duì)于維持腸道黏膜屏障的完整性至關(guān)重要。此外，NSD2缺失的小鼠結(jié)腸組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，增殖細(xì)胞數(shù)量減少，表明NSD2缺失不僅促進(jìn)IEC死亡，還損害了上皮細(xì)胞的自我更新能力。
 
圖3：上皮NSD2缺失加劇屏障功能障礙和細(xì)胞凋亡。
  (A-B) DSS處理的Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠結(jié)腸切片中ZO-1和E-鈣粘蛋白的代表性免疫熒光染色（A）和免疫印跡（B）（每組n=5）。
(C) 通過(guò)檢測(cè)血清中FITC-葡聚糖的濃度來(lái)測(cè)量結(jié)腸通透性（n=4）。
(D) 結(jié)腸切片的TUNEL（上）、C-C3（中）和Ki67（下）染色及定量結(jié)果（n=3）。
(E) Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠的腸上皮細(xì)胞（IECs）的western blot分析。
(F) Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠來(lái)源的腸類(lèi)器官在第4天和第8天的代表性圖像。
(G) 第4天和第8天腸類(lèi)器官的結(jié)構(gòu)定量分析（n=5，每只小鼠30個(gè)類(lèi)器官）。
(H) 在第6天用7-AAD染色24小時(shí)后，類(lèi)器官中凋亡細(xì)胞（7-AAD染成紅色）成像。
 
（4）IECs中NSD2過(guò)表達(dá)預(yù)防DSS誘導(dǎo)的IBD
通過(guò)在IECs中過(guò)表達(dá)NSD2的小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)這些小鼠在DSS誘導(dǎo)的IBD中表現(xiàn)出較少的癥狀，結(jié)腸組織損傷和炎癥特征減少，表明NSD2過(guò)表達(dá)對(duì)IBD具有保護(hù)作用。
  圖4：IECs中NSD2過(guò)表達(dá)預(yù)防DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病（IBD）。
  (A) Nsd2^OE/+小鼠和IECs中NSD2條件性過(guò)表達(dá)（Nsd2^Vil-OE）小鼠的方案（每組n=5）。
(B) Nsd2^OE/+和Nsd2^Vil-OE小鼠的結(jié)腸切片的NSD2免疫熒光染色。
(C) 結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞中NSD2和H3K36me2的免疫印跡。
(D) 經(jīng)或未經(jīng)2% DSS處理的小鼠體重變化（n=5）。
(E) 第10天Nsd2^OE/+和Nsd2^Vil-OE小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度。
(F) 小鼠被處死時(shí)脾臟重量與體重的比值。
(G) Nsd2^OE/+和Nsd2^Vil-OE小鼠經(jīng)或未經(jīng)DSS處理的代表性H&E染色圖像。右側(cè)組織學(xué)評(píng)分。
(H) 經(jīng)DSS處理的Nsd2^OE/+和Nsd2^Vil-OE小鼠結(jié)腸固有層細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析（n=3）。
(I) 通過(guò)RT-qPCR分析結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的相對(duì)mRNA水平（n=3）。
 
（5）NSD2缺失加劇腸道炎癥反應(yīng)
通過(guò)RNA-seq研究發(fā)現(xiàn)NSD2缺失導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞中與免疫細(xì)胞遷移、對(duì)白介素-1的反應(yīng)和急性炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)顯著變化，進(jìn)一步證實(shí)了NSD2缺失加劇腸道炎癥反應(yīng)。
  圖5：NSD2缺失加劇腸道炎癥反應(yīng)。
  (A) 2% DSS處理的Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠IECs中差異表達(dá)基因的熱圖。
(B) 2% DSS處理的Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠之間比較RNA-seq數(shù)據(jù)的火山圖。藍(lán)色點(diǎn)代表下調(diào)基因，紅色點(diǎn)代表上調(diào)基因。
(C) 差異表達(dá)基因的GO分析。
(D) 使用qRT-PCR驗(yàn)證與免疫細(xì)胞遷移、對(duì)白介素-1的反應(yīng)和急性炎癥反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因（每組n=3）。
(E) 與Nsd2缺失相關(guān)的差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）富集圖。
 
（6）NSD2缺失導(dǎo)致Fmo mRNA水平降低并阻礙牛磺酸積累
通過(guò)ChIP-seq分析，研究發(fā)現(xiàn)NSD2缺失導(dǎo)致Fmo2、Fmo4和Fmo5（牛磺酸合成酶）的H3K36me2占據(jù)率降低，mRNA表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致牛磺酸濃度降低。此外，通過(guò)補(bǔ)充Fmo2和Fmo4，可以恢復(fù)牛磺酸水平，表明NSD2通過(guò)調(diào)節(jié)FMOs的表達(dá)來(lái)影響牛磺酸的合成。
 
圖6：NSD2缺失導(dǎo)致Fmo mRNA水平降低并抑制牛磺酸積累。
  (A) Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠結(jié)腸中H3K36me2染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化reads密度，范圍從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游3kb到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TES）下游3kb。
(B) 比對(duì)到基因組注釋的H3K36me2 ChIP peaks。
(C) ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)中顯著受影響基因的重疊分析和代表性KEGG分析。
(D) DSS處理后Nsd2^f/f、Nsd2^Vil-KO、Nsd2^OE/+和Nsd2^Vil-OE小鼠結(jié)腸中Fmo1、Fmo2、Fmo3、Fmo4和Fmo5的定量mRNA表達(dá)水平（每組n=3）。
(E) 使用sg-Ctrl、sgNsd2-1、sgNsd2-2、Ctrl-OE和Nsd2-OE（源自SW620）樣本的Fmo基因的RT-qPCR分析（每組n=3）。
(F) DSS處理（4天）的Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠腸上皮細(xì)胞（IECs）中Fmo2、Fmo4和Fmo5基因位點(diǎn)的H3K36me2 ChIP-seq信號(hào)快照。
(G) Fmo2、Fmo4和Fmo5的ChIP-qPCR。使用的ChIP引物對(duì)位置用綠色箭頭表示（每組n=3）。
(H) 檢測(cè)經(jīng)或未經(jīng)DSS處理的Nsd2^Vil-KO和Nsd2^Vil-OE小鼠及其同窩小鼠IECs中牛磺酸的水平（n=4）。
(I) Nsd2缺失的SW620細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Fmo2和Fmo4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后牛磺酸水平。
(J) IBD樣本（GSE 57945）中Nsd2與Fmo2、Fmo4和Fmo5表達(dá)水平的相關(guān)性。
 
（7）牛磺酸補(bǔ)充可以緩解NSD2缺失IBD小鼠的腸道上皮損傷
通過(guò)給NSD2缺失的小鼠補(bǔ)充牛磺酸，研究發(fā)現(xiàn)其能夠顯著緩解IBD癥狀，包括體重下降、結(jié)腸縮短、脾臟腫大和組織學(xué)損傷，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，恢復(fù)腸道屏障功能。
 
圖7：牛磺酸補(bǔ)充緩解NSD2缺失IBD小鼠的腸道上皮損傷。
  (A) DSS處理和牛磺酸補(bǔ)充方案示意圖。
(B) 體重相對(duì)百分比變化。
(C) 經(jīng)2% DSS處理5天、胃內(nèi)給藥5天后，于第10天處死的Nsd2^f/f和Nsd2^Vil-KO小鼠的結(jié)腸形態(tài)和長(zhǎng)度的代表性圖像及定量分析（n=3）。
(D) 第10天時(shí)脾臟重量與體重的比值。
(E) 有無(wú)牛磺酸補(bǔ)充的Nsd2^Vil-KO小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的H&E染色代表性圖像及組織學(xué)評(píng)分（右）。
(F) DSS處理后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析Nsd2^Vil-KO小鼠結(jié)腸固有層細(xì)胞（n=3）。
(G) 有無(wú)牛磺酸補(bǔ)充的Nsd2^Vil-KO小鼠結(jié)腸組織中Tnf-a、Il-1a、Il-1b、Il-6和Il-13的相對(duì)基因表達(dá)水平。
(H) 遠(yuǎn)端結(jié)腸E-鈣粘蛋白染色的免疫熒光。
(I) 遠(yuǎn)端結(jié)腸ZO-1和E-鈣粘蛋白的western blot分析。
(J) 有無(wú)牛磺酸補(bǔ)充的Nsd2^Vil-KO小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的TUNEL、C-C3和Ki67染色及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。（每組n=3）。
(K) C-C3、caspase-3和C-PARP的western blot分析。
 
易小結(jié)
本研究揭示了NSD2在維持腸道黏膜屏障穩(wěn)態(tài)中的重要作用，特別是其通過(guò)調(diào)節(jié)FMO介導(dǎo)的牛磺酸生物合成來(lái)預(yù)防IBD。研究結(jié)果表明，NSD2缺失不僅加劇腸道炎癥反應(yīng)，還導(dǎo)致腸道屏障功能障礙和細(xì)胞凋亡。通過(guò)補(bǔ)充牛磺酸，可以有效緩解NSD2缺失引起的IBD癥狀。
本研究得出結(jié)論，NSD2在維持FMO介導(dǎo)的牛磺酸生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以預(yù)防腸道炎癥。NSD2-H3K36me2介導(dǎo)的牛磺酸生物合成對(duì)于維持腸道黏膜屏障穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)為IBD治療提供了新的潛在靶點(diǎn)，即通過(guò)調(diào)控NSD2或其下游牛磺酸代謝通路來(lái)治療IBD。

ChIP-seq在本研究中的重要作用
ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序）在本研究中發(fā)揮了重要作用。通過(guò)ChIP-seq分析，研究者能夠鑒定NSD2缺失導(dǎo)致的組蛋白修飾尤其是H3K36me2的變化。這些變化與Fmo基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，揭示了NSD2通過(guò)調(diào)節(jié)H3K36me2來(lái)影響FMOs轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響牛磺酸合成。ChIP-seq技術(shù)為理解NSD2在IBD中的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：
Xu Y, Xiao X, Ma C, Wang Z, Feng W, Rao H, Zhang W, Liu N, Aji R, Meng X, Gao WQ, Li L. Epithelial NSD2 maintains FMO-mediated taurine biosynthesis to prevent intestinal barrier disruption. Clin Transl Med. 2024 Dec;14(12):e70128. doi: 10.1002/ctm2.70128.