抗豬乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體抗體結(jié)構(gòu)與制備流程_abio生物試劑品牌網(wǎng)
抗豬乙型腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）E 蛋白單克隆抗體（mAb）是針對(duì) JEV envelope（E）蛋白的特異性抗體，在豬乙型腦炎的診斷、病毒機(jī)制研究及防控中具有重要作用。以下從抗體結(jié)構(gòu)、靶向 E 蛋白特征、制備流程、特異性及關(guān)鍵參數(shù)等方面詳細(xì)說明：
一、抗體結(jié)構(gòu)特征 抗 JEV E 蛋白單克隆抗體多為鼠源 IgG 類抗體（常見亞型為 IgG1、IgG2a），少數(shù)為 IgM（但因穩(wěn)定性較差，應(yīng)用較少），其基本結(jié)構(gòu)如下：
二、靶向的 E 蛋白及毒株 JEV 的 E 蛋白是病毒包膜表面的主要糖蛋白，全長(zhǎng)約 500 個(gè)氨基酸，負(fù)責(zé)病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞及誘導(dǎo)中和抗體，是疫苗和診斷試劑的核心靶標(biāo)。抗 E 蛋白單抗的靶向?qū)ο蟀ǎ?/span> 1. E 蛋白的核心表位 E 蛋白分為 3 個(gè)結(jié)構(gòu)域（I、II、III）：
三、制備流程及關(guān)鍵參數(shù)
1. 制備步驟
四、特異性與交叉反應(yīng)率
1. 特異性
五、其他核心參數(shù)
六、應(yīng)用場(chǎng)景
一、抗體結(jié)構(gòu)特征 抗 JEV E 蛋白單克隆抗體多為鼠源 IgG 類抗體（常見亞型為 IgG1、IgG2a），少數(shù)為 IgM（但因穩(wěn)定性較差，應(yīng)用較少），其基本結(jié)構(gòu)如下：
- 整體結(jié)構(gòu)：由 2 條重鏈（H 鏈）和 2 條輕鏈（L 鏈）通過二硫鍵連接形成 “Y” 型結(jié)構(gòu)，分子量約 150 kDa（IgG）。
- 功能區(qū)域：
- 可變區(qū)（V 區(qū)）：重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）組成抗原結(jié)合位點(diǎn)（CDR 區(qū)），負(fù)責(zé)特異性識(shí)別 E 蛋白的線性或構(gòu)象表位（E 蛋白的中和表位多為構(gòu)象表位，依賴蛋白空間結(jié)構(gòu)）。
- 恒定區(qū)（C 區(qū)）：重鏈恒定區(qū)（CH1-CH3）決定抗體效應(yīng)功能（如 IgG2a 的 Fc 段可介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC）或補(bǔ)體激活），輕鏈恒定區(qū)（CL）輔助維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
- 關(guān)鍵修飾：部分單抗的 Fc 段存在 N - 糖基化，影響抗體半衰期（體內(nèi)應(yīng)用時(shí)）和與 Fc 受體的結(jié)合能力。
二、靶向的 E 蛋白及毒株 JEV 的 E 蛋白是病毒包膜表面的主要糖蛋白，全長(zhǎng)約 500 個(gè)氨基酸，負(fù)責(zé)病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞及誘導(dǎo)中和抗體，是疫苗和診斷試劑的核心靶標(biāo)。抗 E 蛋白單抗的靶向?qū)ο蟀ǎ?/span> 1. E 蛋白的核心表位 E 蛋白分為 3 個(gè)結(jié)構(gòu)域（I、II、III）：
- 結(jié)構(gòu)域 II（DII）：含融合肽和病毒受體結(jié)合位點(diǎn)，是中和表位的主要區(qū)域，多數(shù)具有中和活性的單抗靶向此區(qū)域。
- 結(jié)構(gòu)域 III（DIII）：含病毒分型相關(guān)表位，部分單抗可識(shí)別此區(qū)域并阻斷病毒與受體結(jié)合。
- 疫苗株：如 SA14-14-2 株（減毒活疫苗，GIII 型，E 蛋白序列穩(wěn)定）、Beijing-1 株。
- 流行野毒株：如 GI-b 亞型的 XZ0934 株、GIII 型的 P3 株等。
- 重組 E 蛋白：通過真核系統(tǒng)（如桿狀病毒 - 昆蟲細(xì)胞、CHO 細(xì)胞）表達(dá)的重組 E 蛋白（保留天然構(gòu)象，含完整中和表位），是單抗制備的主要免疫原。
三、制備流程及關(guān)鍵參數(shù)
1. 制備步驟
- 免疫原制備：優(yōu)先選擇重組 E 蛋白（純度≥95%，濃度 80-100μg / 劑，需驗(yàn)證構(gòu)象完整性），或滅活 JEV 病毒（滴度≥10? PFU/mL）。
- 動(dòng)物免疫：BALB/c 小鼠腹腔免疫，基礎(chǔ)免疫 3 次（間隔 2 周），加強(qiáng)免疫 1 次（融合前 3 天），血清效價(jià)需≥1:10?（間接 ELISA 檢測(cè)，以重組 E 蛋白為包被抗原）。
- 細(xì)胞融合：取免疫小鼠脾臟 B 細(xì)胞與 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞融合，融合率≥40%，雜交瘤克隆形成率≥60%。
- 篩選與克隆：
- 初篩：間接 ELISA（檢測(cè)針對(duì)重組 E 蛋白的抗體）。
- 復(fù)篩：免疫熒光（IFA，檢測(cè)感染 JEV 的 BHK-21 或 C6/36 細(xì)胞中的特異性熒光）、中和試驗(yàn)（檢測(cè)對(duì)活病毒的中和活性，NT??≥1:32 為陽(yáng)性）。
- 克隆純化：有限稀釋法克隆 3 次以上，確保單克隆性（染色體數(shù)目穩(wěn)定，約 90-105 條）。
- 抗體生產(chǎn)：腹水誘生（效價(jià) 1:10?-10?）或無血清懸浮培養(yǎng)（濃度 30-150μg/mL），經(jīng) Protein A/G 親和純化后純度≥95%。
- 雜交瘤穩(wěn)定性：連續(xù)傳代 50 次后，抗體分泌能力無顯著下降（效價(jià)波動(dòng)≤30%）。
- 抗體效價(jià)：ELISA 效價(jià)（腹水）≥1:10?，中和效價(jià)（針對(duì)強(qiáng)毒株）NT??≥1:64。
四、特異性與交叉反應(yīng)率
1. 特異性
- 抗原特異性：僅與 JEV E 蛋白結(jié)合，不識(shí)別 JEV 的其他蛋白（如 C 蛋白、prM 蛋白）。
- 病毒特異性：通過 IFA 和中和試驗(yàn)驗(yàn)證，僅與 JEV 反應(yīng)，不與其他黃病毒（如登革病毒、西尼羅病毒）或豬源病毒（如豬瘟病毒、偽狂犬病病毒）交叉反應(yīng)。
- 與其他黃病毒：JEV 與登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）的 E 蛋白存在部分同源序列，需通過 ELISA 排除交叉（對(duì) DENV/ZIKV 的交叉反應(yīng)率≤3%，即 OD 值比值 < 0.03）。
- 與不同基因型 JEV：優(yōu)質(zhì)單抗可交叉識(shí)別 GI-GV 型毒株（因 E 蛋白保守表位），對(duì) GI 和 GIII 型毒株的識(shí)別率≥95%，對(duì) GV 型的交叉率≥90%。
五、其他核心參數(shù)
- 親和力：通過 SPR 或 ELISA 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定，解離常數(shù)（KD）通常為 10??-10?11 M（KD 值越小，親和力越高，中和活性越強(qiáng)）。
- 中和活性：在細(xì)胞水平可有效抑制 JEV 感染，50% 抑制濃度（IC??）≤0.5μg/mL（針對(duì) 100 TCID??的病毒）。
- 熱穩(wěn)定性：37℃放置 5 天，效價(jià)保留率≥85%；-20℃凍存 2 年，活性無顯著下降。
- 應(yīng)用適應(yīng)性：適用于 ELISA、IFA、Western blot（僅識(shí)別變性 E 蛋白的單抗）、病毒中和試驗(yàn)等，工作濃度范圍：ELISA 1:5000-1:20000，IFA 1:1000-1:5000。
六、應(yīng)用場(chǎng)景
- 診斷試劑：作為捕獲抗體或檢測(cè)抗體用于 JEV 抗原檢測(cè)（如 ELISA 試劑盒）、病毒分型。
- 基礎(chǔ)研究：解析 E 蛋白的功能（如與受體結(jié)合機(jī)制）、病毒入侵途徑。
- 潛在治療：具有強(qiáng)中和活性的單抗可用于豬乙型腦炎的緊急預(yù)防或早期治療（需驗(yàn)證體內(nèi)安全性）。
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