活性氧（ROS）在細胞的生命活動中扮演著極為重要的角色，涉及到細胞的衰老、死亡、癌變。對ROS的檢測是許多課題中的關鍵實驗之一。 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMoel，M9096）是一款靈敏的ROS探針，為科研工作者提供了重要的研究工具。 AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產物、熒光染料、多肽、靶點蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻專利引用。   一、H2DCFDA（DCFH-DA）的機理 H2DCFDA（2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯，AbMole，M9096）是一種常用的活性氧（ROS）熒光探針，廣泛應用于細胞生物學、生物化學和分子生物學等領域的研究。H2DCFDA是一種細胞滲透性指示劑，在細胞內的酯酶作用下，其乙酸基團被去除，產物為H2DCF。此時處于非熒光狀態，并且無法再通過細胞膜。當細胞內存在氧化環境時，H2DCF會被氧化為發綠色熒光的2,7-二氯二氫熒光素（DCF，EX/EM = 488/525 nm），從而可用于檢測細胞內ROS的水平。 圖 1. H2DCFDA檢測ROS的原理   二、H2DCFDA（DCFH-DA）的研究應用 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）作為一種細胞滲透性探針，能夠有效檢測細胞內的氧化應激和ROS水平。H?DCFDA可以檢測過氧化氫（H?O?）、超氧陰離子（O2?）、羥基自由基（·OH）和過氧亞硝酸鹽（ONOO?）等ROS。一般可將細胞與H2DCFDA（多數情況下濃度為10 μM）孵育30分鐘，然后用流式細胞術或者熒光顯微鏡進檢測。注意染色過程中要使用無血清的培養基，以免影響檢測結果。   近年來，鐵死亡（Ferroptosis）研究取得了顯著進展，H?DCFDA作為檢測工具在其中發揮了重要作用。通過檢測細胞內的ROS水平，并結合 ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）進行脂質過氧化檢測，以及 CCK-8（AbMole，M4839）等進行細胞活力分析，可以分析細胞死亡的主要原因和類型。 2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學用于動物體內實驗，相關科研成果發表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。   三、范例詳解 1. Sci Adv. 2024 Aug 16;10(33):eado7249.  蘇州大學第一附屬醫院的研究人員設計了一種水凝膠（FDA-TA），它可通過重塑鐵代謝來修復組織。FDA-TA可以吸附胞外的鐵離子，以調節鐵代謝并抑制鐵死亡，進而促進組織修復。研究者構建了大鼠尾椎穿刺模型，來評估FDA-TA對椎間盤退行性病變（IVDD）的抑制效果。實驗人員在探究鐵離子（Fe3+）能否引起細胞氧化應激和鐵死亡的實驗中，使用了AbMole的 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）和 JC-1 （AbMole，M9724），它們分別被用于檢測活性氧（ROS）的生成和線粒體膜電位的變化[1]。
  圖 2. Fe3+可以誘導細胞氧化應激和線粒體膜電位異常[1]   2. Plant Biotechnol J. 2023 May;21(5):943-960.  蘭州大學、寧夏醫科大學的研究者們在上述論文中研究了C2H2型鋅指轉錄因子OSIC1在楊樹中對滲透脅迫下氣孔關閉的正向調控作用。研究發現，OSIC1在鹽、干旱、 聚乙二醇6000（PEG6000）和 脫落酸（M7597，ABA）誘導下表達上調。過表達OSIC1的轉基因楊樹在上述處理條件下表現出更強的耐受性，這主要是通過減少氣孔開度來實現的。而通過CRISPR/Cas9系統產生的OSIC1突變體則表現出相反的表型。此外，OSIC1能夠直接上調PalCuAOζ的表達，該基因編碼一種含銅多胺氧化酶，可增強保衛細胞（ guard cells，負責儲存淀粉調節滲透壓的細胞）的過氧化氫積累，從而在環境壓力發生時調節氣孔關閉。在這項研究中，AbMole的 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用來檢測楊樹保衛細胞在不同處理條件下的H?O?積累情況[2]。
  圖 3. Detection of H2O2 in guard cells under different treatments[2].   3. Mater Today Bio. 2023 Jun 24;21:100711.  蘇州大學第一附屬醫院的研究者們在上述文章中研發了一種以黑色素為原型的微囊（BHB-PDA-MCs），用于肝纖維化（HF）的抑制。BHB-PDA-MCs的核心為水相，外殼由聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和聚多巴胺納米顆粒（PDANPs）組成。PDANPs是天然黑色素的合成類似物，具有抗氧化特性。而微囊的核心用于封裝酮體β-羥基丁酸（BHB），這是一種已知的免疫代謝調節劑，能夠抑制NLRP3炎癥體的激活。在體外實驗中，PDANPs能夠減輕H2O2誘導的肝細胞（LO2細胞）和肝星狀細胞（HSC-T6細胞）的氧化水平，而BHB能夠減少巨噬細胞（Raw264.7細胞）產生的促炎和促纖維化因子；在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中，研究者發現BHB-PDA-MCs能夠抑制HSCs的激活，減少ECM蛋白的沉積，減輕肝小葉的損傷，并保護肝功能。在這項研究中，AbMole的 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用來檢測LO2和HSC-T6細胞在H2O2刺激下的氧化水平和微囊系統的保護作用。
  圖 4. Fluorescent images showing the ROS levels in LO2 or HSC-T6 cells after co-cultured with blank control, H2O2, or PDA-MCs[3]   AbMole是ChemBridge中國區官方指定合作伙伴。     參考文獻及鳴謝 [1] Y. Xu, F. CAI, Y. Zhou, et al., Magnetically attracting hydrogel reshapes iron metabolism for tissue repair, Science advances 10(33) (2024) eado7249. [2] Q. Bai, Z. Niu, Q. Chen, et al., The C(2) H(2) -type zinc finger transcription factor OSIC1 positively regulates stomatal closure under osmotic stress in poplar, Plant biotechnology journal 21(5) (2023) 943-960. [3] X. Zhao, Z. Fan, C. Zhu, et al., Melanin insPIred microcapsules delivering immune metabolites for hepatic fibrosis management, Materials today. Bio 21 (2023) 100711.