引言：
低輸入RNA-Seq工作流程的試劑和反應體積的小型化和縮小，使研究人員能夠在低樣本輸入和增加樣本數 量的情況下工作。隨著反應體積的減少，試劑體積的準確傳遞成為保持數據質量和技術重復性的關鍵步驟。

我們展示用于測序和Illumina Nextera?XT工作流的Clontech SMART-Seq?v4 Ultra?低輸入RNA試劑盒的 小型化結果，使用緊湊的桌面微流體分配技術生成高質量的RNA- seq樣本。

材料及方法：
SMART-Seq v4 Ultra低輸入RNA試劑盒
SMART?技術(圖1)是基于非模板核苷酸，當其在cDNA合成過程中達到mRNA的5 ‘端時，由基于mmlv的 逆轉錄酶(RT)添加。當一個特殊設計的帶有與這些非模板核苷酸互補序列的SMART寡核苷酸與cDNA第一 鏈雜交時 ，就會發生模板切換。

RT從使用mRNA作為模板轉變為使用SMART 寡核苷酸進行進一步的cDNA合成。這確保了mRNA的5‘端 被捕獲，并允許特定的序列被添加到cDNA的每個端，以更簡單的擴增和豐富全長cDNA。

圖1.SMART cDNA合成技術。

Mantis低通芯片分配
MANTIS?是一個易于編程、低微量移液、低死腔容積、非接觸式試劑分液設備。MANTIS可以配置多達24種 不同的試劑，有100nl – 2 ml的分配范圍，可以分配任何體積到任何孔中，并兼容任意孔板，高達1536孔。

為了減少死死腔容積，試劑可以直接連接到微流控芯片。更可通過使用移液槍頭直接插在芯片上進一步減小 死體積到只有6μL。這個功能是分配NGS樣品準備試劑的理想選擇。

圖2. MANTIS?微流體分配系統

cDNA合成和庫準備
10ng等份的小鼠大腦總RNA和等份1000個細胞(K562細胞系)和陰性對照樣品使用標準全體積反應條件處 理，并與使用SMART-Seq v4超低輸入RNA試劑盒縮小反應體積處理的樣本進行對比。采用8個循環的PCR 擴增cDNA產物試劑體積如表1所示。使用片段分析儀(AATI)對生成的cDNA產物進行了表征，并通過 PIcoGreen?assay進行了定量。

表1. 全反應和小型化 cDNA合成反應試劑體積。
使用MANTIS低通芯片分配緩沖液、引物和預混液試劑。

使用縮減規模的反應體積的Nextera XT 片段文庫試劑盒 (Illumina) )從 100 pg 等份的擴增 cDNA 產物中制備 Illumina 測序文庫，如表 2 所示。與標準完整反應體積進行比較用于說明證實。小型化 Nextera XT 反應條件用于全規模和小型化 cDNA 合成樣品。我們使用12個循環的PCR擴增測序文庫。

表 2. Nextera XT 片段文庫制備試劑體積。使用 MANTIS? 低通量芯片分配試劑。

小型化的cDNA合成和文庫制備條件用于分別使用8、11、14、17個PCR周期處理1000個、100個、10個、1個 細胞樣品的遞減輸入細胞（K562），如果樣品中含有細胞，從減少的數量中擴增cDNA產物。

測序與數據分析
合并索引的樣品，并使用MiSeq進行2x75 bp讀數測序。用CLC Genomics Workbench（8.5.1版）對讀數進 行調整，并使用CLC將其定位到rRNA和線粒體基因組。然后用CLC將未映射的讀數映射到人類基因 組(hg19)和小鼠基因組(mm10)，通過RefSeq掩蔽，產生唯一的映射讀數和%讀數，映射到RefSeq注釋， 包括外顯子、內含子和基因間區域。每個文中鑒定的基因數由RPKM≥0.1的基因數確定。映射到RefSeq 后，使用CLC Genomics Workbench獲得了不同基因的表達水平。

結果：
cDNA合成

圖3.電泳圖，顯示了用于全反應和小型化反應的cDNA產物的等量分布。

表3.用Pico-Green測定測得的cDNA產物產量（ng/μl）。

測序庫準備

圖4.最終片段庫的電泳圖顯示了細胞和RNA輸入樣本的全反應和小規模的 cDNA合成反應的等量分布。

表3.用Pico-Green測定測得的cDNA產物產量（ng /μl）。

測序結果-全反應和小型化反應的比較

表4. 全反應和小型化反應條件的RNA-Seq數據分析比較。

表5.用Pico-Green法測定cDNA產物收率(ng/?μl)。

表6. 使用小型化樣品準備條件減少細胞數量的RNA-Seq數據分析。

總結：
使用Formulaonx Mantis微流控分液系統時，使用Clontech SMART-Seq v4 Ultra低輸入RNA試劑盒減少 用于cDNA合成的試劑量，其結果可媲美全反應體積。從按比例縮小的反應體積的工作流程擴增的cDNA的平均產量與細胞和總RNA的輸入樣本兼容。RNA-Seq數據分析指標在全反應和小型化反應條件之間具有可比性。高產量cDNA合成化學與高精度小劑量試劑分配相結合，提供了非常適合大規模RNA-Seq研究的工作流程。