在單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）中，當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞被捕獲到同一反應(yīng)液滴時(shí)，會(huì)形成雙聯(lián)體（doublet）。在后續(xù)分析中會(huì)因帶有相同的Barcode，會(huì)被認(rèn)為是一個(gè)細(xì)胞的偽細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞會(huì)對(duì)分析產(chǎn)生影響，從而扭曲分析結(jié)果。因此，計(jì)算doublet檢測(cè)方法成為必要工具。

《Benchmarking Computational Doublet-Detection Methods for Single-Cell RNA Sequencing Data》文獻(xiàn)系統(tǒng)性評(píng)估了九種主流方法（包括doubletCells、Scrublet、cxds、bcds、hybrid、Solo、DoubletDetection、DoubletFinder和DoubletDecon），使用16個(gè)真實(shí)數(shù)據(jù)集，并通過(guò)scDesign生成的112個(gè)合成數(shù)據(jù)集，從檢測(cè)的準(zhǔn)確性，下游分析的影響，到計(jì)算效率等各方面評(píng)估。

綜合顯示，DoubletFinder在檢測(cè)準(zhǔn)確性上表現(xiàn)最佳。

DoubletFinder分析可分為4個(gè)步驟：
(1) 利用已有的scRNA-seq數(shù)據(jù)生成doublet；
(2) 對(duì)合并的真實(shí)人工數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理；
(3) 進(jìn)行PCA主成分分析，利用PC距離矩陣求出每個(gè)細(xì)胞的人工k個(gè)最近鄰（pANN）的比例；
(4) 根據(jù)預(yù)期的doublet數(shù)量排序和計(jì)算閾值pANN值。

 
以下是我們分析的示例代碼：

1.讀入單細(xì)胞數(shù)據(jù)，并進(jìn)行一系列預(yù)處理（包括單細(xì)胞數(shù)據(jù)質(zhì)控、標(biāo)準(zhǔn)化、降維聚類(lèi)等）：

seu_kidney <- CreateSeuratObject(kidney.data)

seu_kidney <- NormalizeData(seu_kidney)

seu_kidney <- FindVariableFeatures(seu_kidney, selection.method = "vst", nfeatures = 3000)

seu_kidney <- ScaleData(seu_kidney)

seu_kidney <- RunPCA(seu_kidney)

seu_kidney <- RunUMAP(seu_kidney, dims = 1:20)

選擇統(tǒng)計(jì)上顯著的主成分的數(shù)量，下圖為我們選擇的主成分?jǐn)?shù)量。

 
2. 尋找最優(yōu)pK值：

sweep.res.list_kidney <- paramSweep(seu_kidney, PCs = 1:20, sct = FALSE)

gt.calls <- seu_kidney@meta.data[rownames (sweep.res.list_kidney[[1]]), "GT"]

sweep.stats_kidney <- summarizeSweep(sweep.res.list_kidney, GT = TRUE, GT.calls = gt.calls)

bcmvn_kidney <- find.pK(sweep.stats_kidney)

 
3. 雙細(xì)胞比例計(jì)算：

homotyPIc.prop <- modelHomotypic(annotations)

nExp_poi <- round(0.075*nrow(seu_kidney@meta.data))

nExp_poi.adj <- round(nExp_poi*(1-homotypic.prop))

 
4. 鑒定雙細(xì)胞：

seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:20, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi, reuse.pANN = FALSE, sct = FALSE)

seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:20, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi.adj, reuse.pANN = "pANN_0.25_0.09_913", sct = FALSE)

 
5. 確定了Doublet-Low Confidience， Doublet-High Confidience，Singlet三種細(xì)胞類(lèi)型，并進(jìn)行可視化，包含TSNE和UMAP兩種展示形式：

DimPlot(pbmc, reduction = "tsne", group.by ="DF_hi.lo",cols =c("red","gold","#1bb3b6"),pt.size = 0.8) + ggtitle("DoubletFinder")

DimPlot(pbmc, reduction = "umap", group.by ="DF_hi.lo",cols =c("red","gold","#1bb3b6"),pt.size = 0.8) + ggtitle("DoubletFinder")

 

 
在完成DoubletFinder雙細(xì)胞分析之后，我們可以從單細(xì)胞數(shù)據(jù)的meta.data表中，查看結(jié)果，用于之后的下游分析。

 
以上是對(duì)DoubletFinder雙細(xì)胞分析方法的展示。雙細(xì)胞的去除非常必要，當(dāng)我們剔除這類(lèi)潛在的雙細(xì)胞數(shù)據(jù)后，后續(xù)的分析結(jié)果也就更可靠了。