2025年5月7日，北京大學藥學院王晶課題組聯合中國科學院遺傳與發育生物學研究所武照伐課題組和北京大學生命科學學院李毓龍課題組，在Nature Communications雜志發表題為“A high-performance fluorescent sensor spatiotemporally reveals cell-type specific regulation of intracellular adenosine in vivo”的文章，該研究成功開發了首個用于活體檢測胞內腺苷的基因編碼熒光探針HypnoS（Hypersensitive intracellular adenosine Sensor），并借助活體成像與光遺傳技術等手段，探究了活體動物中胞內腺苷時空動態上的細胞特異性調控，以及背后的分子調控機制（圖1）。
 

圖1. HypnoS的設計、驗證及應用總結

研究團隊基于循環重排綠色熒光蛋白（cpEGFP）與腺苷脫氨酶（PvADA），在篩選了超過3000個突變體后，成功構建了新型熒光探針HypnoS（取名古希臘神話中的“睡神”）。HypnoS具備極高的靈敏度（響應幅度>900%）、適宜的親和力（EC50 ~11 μM）、亞秒級動力學特性及良好的選擇性（圖2），重要的是HypnoS表達對神經元的正常生理過程無明顯影響，這些特性使其成為檢測生理和病理條件下胞內腺苷變化的理想工具。
 

圖2. HypnoS探針的開發和體外刻畫。a. 探針的構成；b. 探針單光子光譜性質；c. 探針親和力，其中HypnoS-mut是探針對照；d. 亞秒級別的動力學特性；e. 優異的特異性；f. 探針幾乎不具備酶活性。

在細胞水平上，腦中不同的類型細胞對胞內腺苷（iAdo）生成、代謝及釋放的差異仍不明確，胞外腺苷（eAdo）來源于神經元還是相鄰的膠質細胞在領域內存在爭議。利用新型HypnoS的可遺傳編碼特性，作者將HypnoS探針分辨表達在了神經元及星形膠質細胞，在原代培養的細胞、急性腦片以及自由活動小鼠等多種體系中實現了對iAdo動態的細胞特異性監測。研究發現神經元和星形膠質細胞腺苷的水平、動力學及釋放存在顯著差異（圖3），提示兩種細胞類型對腺苷穩態的不同貢獻。
 

圖3. 檢測原代培養的神經元與星形膠質細胞中腺苷及ATP代謝差異。a和b. 神經元活動過程中腺苷代謝和ATP能量代謝之間的關系；c和d. 星形膠質細胞鈣活動時胞內腺苷的動態變化。

在病理過程中（如癲癇），腺苷被認為是重要的內源性抗驚厥因子。利用新型HypnoS探針結合在體大視場成像，作者首次在活體小鼠整個大腦皮層尺度可視化了急性癲癇發作期間iAdo的動態變化。研究發現iAdo變化顯著滯后于癲癇引發的神經元鈣活動并持續更長時間，這與iAdo在癲癇發作后的潛在神經保護作用一致（圖4）。進一步地，作者運用活體雙光子成像技術，在單細胞水平解析了iAdo在神經元及星形膠質細胞中的動態變化，并發現星形膠質細胞能夠以更快的速度降解iAdo（圖4），這一發現拓展了不同細胞對癲癇期間腺苷代謝調控機制的理解。
 

圖4. 利用HypnoS檢測癲癇發作過程中胞內腺苷的動態變化。a. 示意圖；b. 結合大視場成像檢測小鼠癲癇發作過程HypnoS與鈣信號之間的時空關系；c. 結合在體雙光子檢測小鼠癲癇發作過程中神經元與星形膠質細胞胞內腺苷動態差異。

在生理過程中（如睡眠-覺醒），腺苷被認為是調控睡眠穩態的重要分子。研究團隊利用HypnoS探針結合光纖和腦電、肌電記錄，在小鼠基底前腦研究中捕捉到清醒與REM睡眠時期胞內腺苷升高，NREM睡眠時期下降的現象。研究表明，ENT1/2在神經元中主導腺苷釋放，而在星形膠質細胞中促進腺苷攝取，揭示了兩種細胞在睡眠穩態中的分工機制（圖5），這一發現為通過調控腺苷水平干預睡眠障礙提供了分子基礎。
 

圖5. 睡眠-覺醒周期中胞內腺苷的動態及細胞特異性調控。a和b. 睡眠-覺醒周期中ENT1/2 介導的腺苷轉運在神經元中的作用。c和d. 睡眠-覺醒周期中ENT1/2 介導的腺苷轉運在星形膠質細胞中的作用。

參考文獻：Wei, Q., BAI, Z., Wang, L. et al. A high-performance fluorescent sensor spatiotemporally reveals cell-type specific regulation of intracellular adenosine in vivo. Nat Commun 16, 4245 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-59530-7

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