RAYPA培養(yǎng)基自動分裝儀在食品中大腸菌群檢測的應用(平板計數法）_abio生物試劑品牌網
方案摘要：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖，產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。本方法利用RAYPA培養(yǎng)基自動分裝儀快速制備實驗所需的培養(yǎng)液、蛋白胨水以及無菌水等，保持無菌環(huán)境、控制溫度避免瓊脂凝固，以提升計數的準確性和操作效率。
方案詳情：
一、實驗原理
大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產酸，在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落，培養(yǎng)基自動分裝儀通過無菌環(huán)境控制、精準定量、溫度維持、自動化操作等原理，解決了大腸桿菌平板計數法中人工操作的痛點（如污染風險高、效率低、誤差大），尤其適用于實驗室的高通量檢測需求。其核心價值在于通過技術手段提升計數結果的準確性、重復性和操作效率，同時降低實驗人員的勞動強度。
二、實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
① 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ ±1℃。
② 冰箱：2 ℃~5 ℃。
③ 恒溫水浴箱：46℃±1℃。
④ 天平：感量 0.1 g。
⑤ 均質器。
⑥ 振蕩器。
⑦ 無菌吸管：1 mL(具 0.01 ml 刻度)、10 mL(具 0.1 ml 刻度)或微量移液器及吸頭。
⑧ 無菌錐形瓶：容量 500 mL。
⑨ 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。
⑩ pH計或pH比色管或精密pH試紙。
? 自動菌落計數儀SHASHIN KAGAKU，PSF-2100。
? 蠕動泵分液器：fluidot 600D
? 電動移液器 PIpetty 10mL
? RAYPA培養(yǎng)基自動分裝儀
2、培養(yǎng)基和試劑
① 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose，LST)肉湯。
② 煌綠乳糖膽鹽( brilliant green lactose bile，BGLB)肉湯。
③ 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂( violet red bile agar，VRBA)。
④ 無菌磷酸鹽緩沖液。
⑤ 無菌生理鹽水。
⑥ 1 mol/L NaOH 溶液。
⑦ 1 mol/L HCl溶液。
三、檢驗程序
1、大腸菌群平板計數法的檢驗程序如下：
四、實驗步驟
1、樣品稀釋
固體和半固體樣品：稱取 25g樣品，放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內 ，8000 r/min~10 000 r/min 均質1 min~2 min，或放人盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min~2 min，制成1：10 的樣品勻液。
液體樣品：以無菌吸管吸取 25 mL，樣品置盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖，充分混勻，制成1：10 的樣品勻液。
2、樣品勻液的pH應在 6.5~7.5之間，必要時分別用1 mol/L， NaOH 或1 mol/L HCl調節(jié)。
3、使用Pipetty電動移液器吸取1：10 樣品勻液1mL沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支1 mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。
4、根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。
5 、選取2個~3 個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
6、及時將 15 mL~20 mL融化并恒溫至 46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂( VRBA)約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL~4 mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。
7、選取菌落數在15 CFU~150 CFU之間的平板，分別計數平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落(如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm或更大，最低稀釋度平板低于15 CFU 的記錄具體菌落數。
8、從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養(yǎng) 24h~48 h，觀察產氣情況。凡 BGLB肉湯管產氣即可報告為大腸菌群陽性。
五、結果及報告
經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例：10-'樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：100x6/10X10'/g(mL)=6.0X10’CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
方案詳情：
一、實驗原理
大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產酸，在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落，培養(yǎng)基自動分裝儀通過無菌環(huán)境控制、精準定量、溫度維持、自動化操作等原理，解決了大腸桿菌平板計數法中人工操作的痛點（如污染風險高、效率低、誤差大），尤其適用于實驗室的高通量檢測需求。其核心價值在于通過技術手段提升計數結果的準確性、重復性和操作效率，同時降低實驗人員的勞動強度。
二、實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
① 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ ±1℃。
② 冰箱：2 ℃~5 ℃。
③ 恒溫水浴箱：46℃±1℃。
④ 天平：感量 0.1 g。
⑤ 均質器。
⑥ 振蕩器。
⑦ 無菌吸管：1 mL(具 0.01 ml 刻度)、10 mL(具 0.1 ml 刻度)或微量移液器及吸頭。
⑧ 無菌錐形瓶：容量 500 mL。
⑨ 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。
⑩ pH計或pH比色管或精密pH試紙。
? 自動菌落計數儀SHASHIN KAGAKU，PSF-2100。
? 蠕動泵分液器：fluidot 600D
? 電動移液器 PIpetty 10mL
? RAYPA培養(yǎng)基自動分裝儀
2、培養(yǎng)基和試劑
① 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose，LST)肉湯。
② 煌綠乳糖膽鹽( brilliant green lactose bile，BGLB)肉湯。
③ 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂( violet red bile agar，VRBA)。
④ 無菌磷酸鹽緩沖液。
⑤ 無菌生理鹽水。
⑥ 1 mol/L NaOH 溶液。
⑦ 1 mol/L HCl溶液。
三、檢驗程序
1、大腸菌群平板計數法的檢驗程序如下：
四、實驗步驟
1、樣品稀釋
固體和半固體樣品：稱取 25g樣品，放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內 ，8000 r/min~10 000 r/min 均質1 min~2 min，或放人盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min~2 min，制成1：10 的樣品勻液。
液體樣品：以無菌吸管吸取 25 mL，樣品置盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖，充分混勻，制成1：10 的樣品勻液。
2、樣品勻液的pH應在 6.5~7.5之間，必要時分別用1 mol/L， NaOH 或1 mol/L HCl調節(jié)。
3、使用Pipetty電動移液器吸取1：10 樣品勻液1mL沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支1 mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。
4、根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。
5 、選取2個~3 個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
6、及時將 15 mL~20 mL融化并恒溫至 46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂( VRBA)約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL~4 mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。
7、選取菌落數在15 CFU~150 CFU之間的平板，分別計數平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落(如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm或更大，最低稀釋度平板低于15 CFU 的記錄具體菌落數。
8、從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養(yǎng) 24h~48 h，觀察產氣情況。凡 BGLB肉湯管產氣即可報告為大腸菌群陽性。
五、結果及報告
經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例：10-'樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：100x6/10X10'/g(mL)=6.0X10’CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
本站“ABIO生物試劑品牌網”圖片文字來自互聯(lián)網
如果有侵權請聯(lián)系微信: nanhu9181 處理，感謝~
