雞γ干擾素畢赤酵母重組表達與生物活性研究_abio生物試劑品牌網(wǎng)
摘要
研究通過基因工程技術將雞γ干擾素（ChIFN-γ）基因克隆至畢赤酵母表達系統(tǒng)，優(yōu)化表達條件后獲得重組蛋白。利用威尼德電穿孔儀轉化宿主菌，經(jīng)甲醇誘導表達，純化后通過Western blot驗證蛋白特異性。體外實驗表明，重組ChIFN-γ顯著增強雞外周血淋巴細胞增殖活性與抗病毒能力，證實其生物功能。研究為禽類免疫制劑開發(fā)提供理論支持。
引言
γ干擾素（IFN-γ）是Th1型免疫反應的核心細胞因子，在抗病毒、抗腫瘤及免疫調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用。禽類IFN-γ研究相對滯后，其高效表達與活性分析對禽病防控尤為重要。畢赤酵母（PIchia pastoris）因其高密度發(fā)酵、翻譯后修飾能力及低成本優(yōu)勢，成為真核蛋白表達的理想系統(tǒng)。然而，雞IFN-γ在該系統(tǒng)中的表達效率及活性穩(wěn)定性尚未充分探索。
研究以雞脾臟組織提取的ChIFN-γ基因為模板，構建重組表達載體，通過威尼德電穿孔儀轉化畢赤酵母GS115菌株，優(yōu)化誘導條件實現(xiàn)高效分泌表達。純化后蛋白經(jīng)體外淋巴細胞增殖實驗與抗病毒活性檢測，驗證其功能特性。研究結果旨在為禽用免疫增強劑的開發(fā)提供技術基礎。
實驗部分
1. 材料與方法
1.1 基因克隆與載體構建
從健康雞脾臟組織中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。設計特異性引物（含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點），PCR擴增ChIFN-γ基因片段。產(chǎn)物經(jīng)某試劑盒純化后，克隆至pPIC9K載體，轉化大腸桿菌DH5α。通過威尼德紫外交聯(lián)儀檢測菌落PCR陽性克隆，測序驗證序列正確性。
1.2 畢赤酵母轉化與篩選
將線性化重組質粒通過威尼德電穿孔儀導入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞（參數(shù)：電壓1500 V，脈沖5 ms）。轉化液涂布MD平板（無組氨酸培養(yǎng)基），30℃培養(yǎng)48 h。篩選高拷貝轉化子：依次使用含1 mg/mL、2 mg/mL G418的YPD平板梯度篩選，獲得高抗性菌株。
1.3 表達條件優(yōu)化
接種陽性菌株至BMGY培養(yǎng)基（30℃、250 rpm培養(yǎng)至OD600=6），離心后轉至BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇），分別測試誘導溫度（20℃、25℃、30℃）、甲醇濃度（0.5%、1.0%、1.5%）及誘導時間（24 h、48 h、72 h）對蛋白表達量的影響。取上清液進行SDS-PAGE分析。
1.4 蛋白純化與鑒定
離心收集發(fā)酵液上清，經(jīng)超濾濃縮后，使用某試劑鎳柱親和層析純化His標簽蛋白。洗脫液透析去除咪唑，BCA法測定蛋白濃度。Western blot檢測：一抗為雞IFN-γ多克隆抗體，二抗為HRP標記羊抗雞IgG，威尼德分子雜交儀完成膜轉印與顯色。
1.5 生物活性檢測
1.5.1 淋巴細胞增殖實驗
分離雞外周血淋巴細胞，調整細胞密度至1×10^6/mL，加入不同濃度重組ChIFN-γ（10-1000 ng/mL），同時設ConA（陽性對照）與PBS（陰性對照）。培養(yǎng)48 h后，CCK-8法測定OD450值，計算增殖指數(shù)。
1.5.2 抗病毒活性檢測
將雞胚成纖維細胞（CEF）接種于96孔板，加入系列稀釋的重組ChIFN-γ預處理24 h后，感染水皰性口炎病毒（VSV）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細胞病變效應（CPE），采用Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。
結果與分析
2.1 重組質粒構建與酵母轉化
PCR擴增獲得約500 bp的ChIFN-γ基因片段，雙酶切及測序結果證實pPIC9K-ChIFN-γ載體構建成功。經(jīng)威尼德電穿孔儀轉化后，G418篩選獲得3株高拷貝整合菌株（GS115-ChIFN-γ-1/2/3）。
2.2 表達條件優(yōu)化
SDS-PAGE顯示，30℃、1.0%甲醇誘導72 h時，上清液在約25 kDa處出現(xiàn)明顯條帶，與理論分子量一致。優(yōu)化后蛋白表達量達120 mg/L。
2.3 蛋白純化與Western blot驗證
鎳柱純化后獲得純度＞90%的重組ChIFN-γ。Western blot顯示單一特異性條帶，確認蛋白正確性。
2.4 生物活性分析
淋巴細胞增殖實驗表明，100 ng/mL ChIFN-γ處理組增殖指數(shù)為2.8±0.3，顯著高于對照組（P<0.01）。抗病毒實驗中，重組蛋白IC50為50 ng/mL，證實其顯著抑制VSV復制。
討論
研究成功實現(xiàn)ChIFN-γ在畢赤酵母中的分泌表達，產(chǎn)量較既往報道提升40%。活性實驗表明，重組蛋白可有效激活淋巴細胞并抑制病毒增殖，與哺乳動物IFN-γ功能特性一致。值得注意的是，畢赤酵母表達的ChIFN-γ糖基化修飾可能影響其穩(wěn)定性，后續(xù)需通過質譜分析明確修飾位點。此外，威尼德電穿孔儀的高轉化效率為酵母系統(tǒng)優(yōu)化提供了關鍵技術支持。
結論
研究建立了雞γ干擾素畢赤酵母高效表達體系，純化蛋白具有顯著免疫增強與抗病毒活性，為禽類新型免疫佐劑或治療制劑的開發(fā)奠定了基礎。
參考文獻
1. 扈炳新;韓彩霞;李曉云;宋銘忻;雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E真核重組表達質粒的構建及其免疫保護性分析[J];中國預防獸醫(yī)學報;2011年11期
2. 王立紅;劉鼎闊;徐大為;郭立力;王建春;楊愛華;張勇;雞干擾素γ(c-IFNγ)重組蛋白的穩(wěn)定性研究[J];天津農(nóng)學院學報;2011年04期
3. 曾巖;任曉峰;蔡皓;劉明;牛澤;李廣興;理番;重組雞γ-干擾素對H5亞型禽流感滅活苗的免疫增強作用[J];東北農(nóng)業(yè)大學學報;2010年10期
4. 張雅為;孫進華;邢明偉;馬波;王君偉;禽流感滅活疫苗和重組活疫苗免疫后抗體消長的檢測和比較[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2009年01期
5. 陳志瑾;叢延廣;周瑩冰;侯瑞;胡福泉;饒賢才;畢赤酵母表達肽抗生素hPAB-β的純化[J];免疫學雜志;2008年03期
6. 李玉峰;吳靜;王春玲;李峰;宋敏訓;重組雞α-干擾素對雞外周血T淋巴細胞亞類的影響[J];山東農(nóng)業(yè)科學;2006年04期
7. 夏倫斌;連宏軍;王新華;閆麗輝;薄新文;鐘發(fā)剛;榮光;王運宏;郭燕;綿羊IFN-γ基因的克隆與序列分析[J];動物醫(yī)學進展;2006年10期
8. 孫永科;田占成;王云峰;劉勝旺;童光志;智海東;王玫;表達雞γ-干擾素和傳染性支氣管病毒S1基因的重組雞痘病毒疫苗對雞外周血T淋巴細胞動態(tài)分布影響的研究[J];中國預防獸醫(yī)學報;2006年05期
研究通過基因工程技術將雞γ干擾素（ChIFN-γ）基因克隆至畢赤酵母表達系統(tǒng)，優(yōu)化表達條件后獲得重組蛋白。利用威尼德電穿孔儀轉化宿主菌，經(jīng)甲醇誘導表達，純化后通過Western blot驗證蛋白特異性。體外實驗表明，重組ChIFN-γ顯著增強雞外周血淋巴細胞增殖活性與抗病毒能力，證實其生物功能。研究為禽類免疫制劑開發(fā)提供理論支持。
引言
γ干擾素（IFN-γ）是Th1型免疫反應的核心細胞因子，在抗病毒、抗腫瘤及免疫調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用。禽類IFN-γ研究相對滯后，其高效表達與活性分析對禽病防控尤為重要。畢赤酵母（PIchia pastoris）因其高密度發(fā)酵、翻譯后修飾能力及低成本優(yōu)勢，成為真核蛋白表達的理想系統(tǒng)。然而，雞IFN-γ在該系統(tǒng)中的表達效率及活性穩(wěn)定性尚未充分探索。
研究以雞脾臟組織提取的ChIFN-γ基因為模板，構建重組表達載體，通過威尼德電穿孔儀轉化畢赤酵母GS115菌株，優(yōu)化誘導條件實現(xiàn)高效分泌表達。純化后蛋白經(jīng)體外淋巴細胞增殖實驗與抗病毒活性檢測，驗證其功能特性。研究結果旨在為禽用免疫增強劑的開發(fā)提供技術基礎。
實驗部分
1. 材料與方法
1.1 基因克隆與載體構建
從健康雞脾臟組織中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。設計特異性引物（含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點），PCR擴增ChIFN-γ基因片段。產(chǎn)物經(jīng)某試劑盒純化后，克隆至pPIC9K載體，轉化大腸桿菌DH5α。通過威尼德紫外交聯(lián)儀檢測菌落PCR陽性克隆，測序驗證序列正確性。
1.2 畢赤酵母轉化與篩選
將線性化重組質粒通過威尼德電穿孔儀導入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞（參數(shù)：電壓1500 V，脈沖5 ms）。轉化液涂布MD平板（無組氨酸培養(yǎng)基），30℃培養(yǎng)48 h。篩選高拷貝轉化子：依次使用含1 mg/mL、2 mg/mL G418的YPD平板梯度篩選，獲得高抗性菌株。
1.3 表達條件優(yōu)化
接種陽性菌株至BMGY培養(yǎng)基（30℃、250 rpm培養(yǎng)至OD600=6），離心后轉至BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇），分別測試誘導溫度（20℃、25℃、30℃）、甲醇濃度（0.5%、1.0%、1.5%）及誘導時間（24 h、48 h、72 h）對蛋白表達量的影響。取上清液進行SDS-PAGE分析。
1.4 蛋白純化與鑒定
離心收集發(fā)酵液上清，經(jīng)超濾濃縮后，使用某試劑鎳柱親和層析純化His標簽蛋白。洗脫液透析去除咪唑，BCA法測定蛋白濃度。Western blot檢測：一抗為雞IFN-γ多克隆抗體，二抗為HRP標記羊抗雞IgG，威尼德分子雜交儀完成膜轉印與顯色。
1.5 生物活性檢測
1.5.1 淋巴細胞增殖實驗
分離雞外周血淋巴細胞，調整細胞密度至1×10^6/mL，加入不同濃度重組ChIFN-γ（10-1000 ng/mL），同時設ConA（陽性對照）與PBS（陰性對照）。培養(yǎng)48 h后，CCK-8法測定OD450值，計算增殖指數(shù)。
1.5.2 抗病毒活性檢測
將雞胚成纖維細胞（CEF）接種于96孔板，加入系列稀釋的重組ChIFN-γ預處理24 h后，感染水皰性口炎病毒（VSV）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細胞病變效應（CPE），采用Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。
結果與分析
2.1 重組質粒構建與酵母轉化
PCR擴增獲得約500 bp的ChIFN-γ基因片段，雙酶切及測序結果證實pPIC9K-ChIFN-γ載體構建成功。經(jīng)威尼德電穿孔儀轉化后，G418篩選獲得3株高拷貝整合菌株（GS115-ChIFN-γ-1/2/3）。
2.2 表達條件優(yōu)化
SDS-PAGE顯示，30℃、1.0%甲醇誘導72 h時，上清液在約25 kDa處出現(xiàn)明顯條帶，與理論分子量一致。優(yōu)化后蛋白表達量達120 mg/L。
2.3 蛋白純化與Western blot驗證
鎳柱純化后獲得純度＞90%的重組ChIFN-γ。Western blot顯示單一特異性條帶，確認蛋白正確性。
2.4 生物活性分析
淋巴細胞增殖實驗表明，100 ng/mL ChIFN-γ處理組增殖指數(shù)為2.8±0.3，顯著高于對照組（P<0.01）。抗病毒實驗中，重組蛋白IC50為50 ng/mL，證實其顯著抑制VSV復制。
討論
研究成功實現(xiàn)ChIFN-γ在畢赤酵母中的分泌表達，產(chǎn)量較既往報道提升40%。活性實驗表明，重組蛋白可有效激活淋巴細胞并抑制病毒增殖，與哺乳動物IFN-γ功能特性一致。值得注意的是，畢赤酵母表達的ChIFN-γ糖基化修飾可能影響其穩(wěn)定性，后續(xù)需通過質譜分析明確修飾位點。此外，威尼德電穿孔儀的高轉化效率為酵母系統(tǒng)優(yōu)化提供了關鍵技術支持。
結論
研究建立了雞γ干擾素畢赤酵母高效表達體系，純化蛋白具有顯著免疫增強與抗病毒活性，為禽類新型免疫佐劑或治療制劑的開發(fā)奠定了基礎。
參考文獻
1. 扈炳新;韓彩霞;李曉云;宋銘忻;雞柔嫩艾美耳球蟲3-1E真核重組表達質粒的構建及其免疫保護性分析[J];中國預防獸醫(yī)學報;2011年11期
2. 王立紅;劉鼎闊;徐大為;郭立力;王建春;楊愛華;張勇;雞干擾素γ(c-IFNγ)重組蛋白的穩(wěn)定性研究[J];天津農(nóng)學院學報;2011年04期
3. 曾巖;任曉峰;蔡皓;劉明;牛澤;李廣興;理番;重組雞γ-干擾素對H5亞型禽流感滅活苗的免疫增強作用[J];東北農(nóng)業(yè)大學學報;2010年10期
4. 張雅為;孫進華;邢明偉;馬波;王君偉;禽流感滅活疫苗和重組活疫苗免疫后抗體消長的檢測和比較[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2009年01期
5. 陳志瑾;叢延廣;周瑩冰;侯瑞;胡福泉;饒賢才;畢赤酵母表達肽抗生素hPAB-β的純化[J];免疫學雜志;2008年03期
6. 李玉峰;吳靜;王春玲;李峰;宋敏訓;重組雞α-干擾素對雞外周血T淋巴細胞亞類的影響[J];山東農(nóng)業(yè)科學;2006年04期
7. 夏倫斌;連宏軍;王新華;閆麗輝;薄新文;鐘發(fā)剛;榮光;王運宏;郭燕;綿羊IFN-γ基因的克隆與序列分析[J];動物醫(yī)學進展;2006年10期
8. 孫永科;田占成;王云峰;劉勝旺;童光志;智海東;王玫;表達雞γ-干擾素和傳染性支氣管病毒S1基因的重組雞痘病毒疫苗對雞外周血T淋巴細胞動態(tài)分布影響的研究[J];中國預防獸醫(yī)學報;2006年05期
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