真核細胞釋放到細胞外空間的小泡稱為細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）。EV在細胞間和種間通訊及免疫反應中起重要作用。到目前為止，科學界將細胞外囊泡(extracellular vesicle)大致分為三大類：微泡(microvesicle)、凋亡小體(apoptotic body)和外泌體(exosome)。微泡是指由細胞分泌的一種直徑為100～1000nm的膜囊泡；凋亡小體是指細胞程序性死亡過程中所釋放的一種直徑為500～4000nm的膜囊泡。

        外泌體則是一種直徑為30～100nm、主要由細胞內多泡體與細胞膜融合并釋放到細胞外基質中的膜囊泡，在電鏡下表現(xiàn)為脂質雙層包裹的扁平球體，呈特征性的杯狀外形。許多哺乳動物細胞有釋放外泌體的能力，包括網織紅細胞、樹突狀細胞、B細胞、T細胞、肥大細胞、上皮細胞、腫瘤細胞等。在動物細胞中發(fā)現(xiàn)外泌體后，越來越多的證據表明在植物中會出現(xiàn)MVB和類似外泌體的囊泡。這些發(fā)現(xiàn)主要集中在細胞生長和分化（包括與細胞壁相關的過程）研究上，或集中在植物對各種脅迫的反應上。

        除了動物體液外，許多植物中也發(fā)現(xiàn)含蛋白質和小RNA的外泌體樣納米粒子，如生姜、胡蘿卜、西瓜葡萄、橄欖、瓜子。這些植物外泌體由于缺乏毒性，有大規(guī)模生產的可能性，其內在特性和攜帶藥物或小RNA分子等其他化合物的可能性，在醫(yī)療應用中引起了廣泛關注。Regente等于2009年首次發(fā)現(xiàn)植物中存在外泌體樣小泡，該小泡在向日葵種子中直徑為50~200nm。其后許多研究集中于囊泡及其生物活性成分的深層表征，以更好地了解其內在特性和可能的生物技術應用。

圖1      植物外泌體

一、植物外泌體的分泌方式和物質構成          植物外泌體與動物外泌體形態(tài)結構類似，有磷脂雙分子層結構，含有蛋白質和微小RNA，呈茶托狀或杯狀，其形態(tài)可利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察。蛋白質分析表明，包含參與信號傳遞的蛋白質，其中許多蛋白質在應激和免疫反應中被高度誘導；還包含涉及活性氧信號傳導和氧化應激反應的蛋白質，及各種膜轉運蛋白和囊泡內轉運蛋白。植物外泌體含有較豐富的miRNA，其為一類長度約為22個核苷酸的內源單鏈非編碼RNA，在生物體中起重要作用，是一種高效的基因表達調控因子。越來越多研究顯示，miRNA不僅在其原始系統(tǒng)內執(zhí)行生物學功能，還可進行跨界基因表達調控。
二、植物外泌體的分離純化及鑒定
2.1 植物外泌體的分離純化
         目前，外泌體的分離方法主要包括超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、超濾離心法、免疫親和法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色譜法和微流控技術。這些分離方法均有各自的優(yōu)勢和局限性。超速離心法和蔗糖密度梯度離心法利用外泌體與其他組分在密度和大小上的差異，通過不同的離心力分離外泌體，操作簡單、獲得的外泌體數量較多，但工藝費時、回收率不穩(wěn)定，反復離心可能會對外泌體造成損傷。超濾離心法是基于粒子大小的分離技術，利用超濾膜將外泌體從蛋白質等生物大分子中分離，不影響外泌體的生物活性，但可能損傷外泌體，不能保持其形態(tài)。免疫親和法是基于外泌體表面的受體對其進行分離，能分離所有外泌體或外泌體的選擇性亞型，但這種方法成本高，使用條件苛刻，不適于大量樣品，且此方法分離的囊泡可能失去原有的功能活性。聚合物沉淀法利用聚合物（如聚乙二醇）劫持水分子，使外泌體溶解度下降，再通過低速離心分離，操作簡單、無需專門設備，目前已實現(xiàn)商品化，但提取過程中脂蛋白和聚合物之間可能產生沉淀，導致外泌體純度降低。尺寸排阻色譜法是基于分離分子的大小和尺寸進行分離，分離純度高、可保證外泌體的完整性和生物活性，但提取的外泌體濃度低，后續(xù)應用需濃縮，且需專業(yè)設備。近年，新發(fā)展的微流控技術是一種基于外泌體生物化學和物理性質差異的微尺度分離技術，樣品處理速度快、成本低、靈敏度高，但產量較低，僅適用于診斷；還有試劑盒提取外泌體，此法操作簡單便捷，不需特殊設備，隨著產品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，但市場上各類產品分離純化效果良莠不齊。

圖2      不同植物外泌體提取方法的原理、優(yōu)缺點

        目前，大多用超速離心法和蔗糖密度梯度離心法提取植物外泌體。Regente等最早從向日葵種子中提取細胞外囊泡。將20g種子中提取的細胞外液通過0.5μm膜過濾，并通過連續(xù)離心步驟分別按照步驟10,000g離心30min，40,000g離心60min和100,000g離心60min分級分離。棄去第一個沉淀，將40,000g和100,000g沉淀部分分別重懸在Tris-HCl pH7.5緩沖液中。結果在40,000g部分有較高密度50~200nm囊泡樣小泡。Brian等提取擬南芥葉片的細胞外囊泡，將上述方法40,000g離心部分在OptiPrep密度梯度中純化。Wang等分離柚子的細胞外囊泡，去除果皮，將果肉在高速混合器中于4℃下均化1min。依次將收集的汁液以20,000g離心20min，然后以10,000g離心1h除去碎屑。將納米囊泡以150,000g沉淀1.5h，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌1次，然后使用蔗糖梯度（分別為8%，30%，45%和60%）純化和分離。

        綜上，植物外泌體的提取方法一般是將待提取部位處理后，先低速離心除去雜質，再高速離心分離外泌體，然后使用密度梯度純化。根據提取的植物種類、部位及作用目的不同在實驗中對提取方法進行調整。

2.2 植物外泌體的鑒定          可使用納米顆粒跟蹤分析儀（NTA）平臺、BCA比色法或Bio-Rad蛋白質定量測定試劑盒，通過比較納米囊泡計數與蛋白質濃度的比值估算囊泡制劑的純度；使用電子顯微鏡檢查，觀察到外泌體的杯狀圓形結構，動態(tài)光散射分析其粒徑大小約為40~100 nm；流式細胞分析（FACS）進一步證實了所研究囊泡的同源性；采用液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）技術對外泌體進行廣泛的蛋白質分析，將其與已知的植物外泌體蛋白質進行比對分析。

        目前，對植物外泌體的鑒定主要是采用電子顯微鏡觀察形態(tài)和動態(tài)光散射分析粒徑分布。動物外泌體已有標記蛋白可確定，但植物外泌體在這方面的研究還不成熟。

三、植物外泌體的功能及應用          植物外泌體作為一個有前途的研究領域的潛力，對人類疾病的治療具有廣泛的意義。其中包括腫瘤治療、抗菌和調控腸道菌群、抗纖維化、抗病毒、藥物遞送載體、基因載體等方向。

圖3       植物外泌體的生物學功能

3.1 植物外泌體在腫瘤治療中的作用          目前外泌體在腫瘤方面的研究多聚焦于腫瘤細胞外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的信息傳遞作用，從而以特定外泌體作為腫瘤監(jiān)測的生物標志物，以及以外泌體作為藥物載體進行腫瘤細胞靶向治療?，F(xiàn)今植物外泌體對腫瘤細胞生物學行為的影響以及可能的機制也已開展研究，已有研究表明某些植物外泌體對于腫瘤細胞增殖具有抑制作用，探究植物外泌體對腫瘤細胞的影響具有重要的應用價值。Potestà等從藥用植物辣木提取物中分離出的辣木外泌體可以通過減少腫瘤細胞BCL2的蛋白表達、降低降低細胞線粒體膜電位從而促進腫瘤細胞的凋亡和抑制腫瘤細胞ze增殖，減少腫瘤的發(fā)生。miR159是一種植物miRNA。研究發(fā)現(xiàn)miR159可在乳腺癌患者血清中檢出，并且其豐度水平與乳腺癌的發(fā)病率及乳腺癌的進程呈負相關。在體內和離體研究證實通過miR159靶向乳腺腫瘤細胞中編碼Wnt信號轉錄因子的TCF7，降低MYC蛋白水平，抑制Wnt信號信號通路，從而抑制腫瘤細胞的生長增殖。 3.2 植物外泌體抗菌和調控腸道菌群作用          牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis）屬于革蘭氏陰性厭氧菌的一種，其作為主要病原體可以引起慢性牙周炎。許多致病因子可以由牙齦卟啉單胞菌產生，進而導致牙齒周圍的組織降解，引發(fā)破壞性免疫反應，最終演變?yōu)槁匝乐苎?。從生姜中提取的外泌體（gingerexosome-likenanoparticles，GELNs）內含脂質、少量蛋白質、125種以上microRNAs（miRNAs）和大量生物活性物質（6-姜酚和6-姜烯酚）。小鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)生姜外泌體可以選擇性結合牙齦卟啉單胞菌表面的血紅素結合蛋白35（hemin-bindingprotein35，HBP35）從而影響該菌的生長、附著和遷移，降低該菌的致病性，有效控制慢性牙周炎的發(fā)展。

        Crohn’s病和潰瘍性結腸炎是臨床常見的慢性腸道疾病。Zhang等通過無菌小鼠以及臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)生姜外泌體中的小RNA能作用于腸道菌群，對腸道菌群的組成產生影響，可增加乳桿菌和擬桿菌，減少梭菌數量。生姜外泌體與腸道細菌接觸被吸收，可以調節(jié)細菌某些基因表達和蛋白生成。通過激活AHR（ArylHydrocarbonReceptor）途徑誘導IL-22表達使以益生菌作為媒介轉導的結腸炎抑制作用得以加強。此外有研究發(fā)現(xiàn)生姜所產生的外泌體可以抑制炎性細胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表達以及增加結抗炎細胞因子（IL-10和IL-22）的表達。此外生姜外泌體還能起到完善腸道屏障的功能。

3.3 植物外泌體的抗纖維化作用          肺損傷后過多的細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）成分（如纖連蛋白，間質膠原，蛋白聚糖和透明質酸）的積累，嚴重可導致肺纖維化。綜合所有對于肺纖維化的治療方法，其中肺移植的療效較好，但由于肺源的稀缺，對該方法的應用產生很大的限制。Du等從植物紅景天（Rhodiolacrenulata，HJT）中提取的內含HJT-sRNA-m7的外泌體能有效地降低小鼠α平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA），纖連蛋白和Iα1型膠原蛋白（COL1A1）在基因水平和蛋白水平的表達，減輕小鼠肺纖維化，具有良好的抗纖維化作用。 3.4 植物外泌體的抗病毒作用          金銀花（Honeysuckle，HS）是中國傳統(tǒng)中藥材，常用于感冒治療，現(xiàn)代醫(yī)學證實其可有效抑制流感病毒復制。周等從金銀花水煎液中提取到miRNA2911，對其進行體內和體外的抗病毒實驗。在H1N1病毒感染的小鼠實驗中，研究人員發(fā)現(xiàn)，miRNA2911可有效改善感染流感后所引起的體重降低，提高了小鼠的存活率。在針對其他流感病毒如H5N1和H9N7感染小鼠的實驗中，miRNA2911抑制病毒的復制，降低這兩種病毒感染的死亡率。體外實驗顯示miRNA2911能夠在體外與甲型流感病毒結合，抑制控制H1N1病毒編碼的PB2和NS1蛋白的表達。由于PB2和NS1基因是流感病毒復制所必備的，所以miRNA2911可以有效地抑制流感病毒的復制。 3.5 植物外泌體作為藥物傳遞載體          外泌體作為 30～150nm 的生物納米級囊泡結構，一方面可攜帶豐富的蛋白質、RNA、脂類等生物活性分子，是多功能載體，具有在細胞間傳遞信號的重要作用。另一方面，外泌體天然擁有穿越生物屏障（例如血腦屏障）的能力，還可以遷移到不具備血液供應的的組織或區(qū)域，如致密軟骨基質。外泌體可以在目標組織區(qū)域內停留很長的一段時間。同時對外泌體還可以進行基因工程改造，這是其另一個重要的特征，經過改造之后的外泌體的表面蛋白可以行使很多既定的功能。如：可以在其表面修飾靶向細胞或組織肽，對于特定組織有選擇性的靶向針對，使其在其他的器官中數量無法積聚，從而降低全身毒性。外泌體被認為是良好的藥物遞送載體。 3.6 外泌體作為遞送基因載體用于基因治療          基因療法通過引入遺傳物質來治療疾病，這讓很多之前無法治愈的疾病，如腫瘤、遺傳性疾病和自身免疫性疾病的治療有了不錯的療效，為患者帶來了希望。基因治療中通常使用mRNA和病毒或非病毒質粒DNA作為遺傳物質。帶負電的核酸難以透過細胞膜，且治療用遺傳物質在體內很脆弱，易于降解或中和，損害基因治療的效果，因此，遺傳物質遞送是基因治療的關鍵。外泌體作為各種遺傳物質的載體對遺傳物質進行封裝并通過質膜將其遞送到細胞中治療相關疾病，這種方法大大增強療效以及降低了治療過程中可能出現(xiàn)的風險。隨著人們對于基因編輯技術的研究愈發(fā)深入，通過以外泌體載體為基礎的靶向基因療法進行疑難雜癥的治療的應用前景十分廣闊。

        由于植物細胞外納米囊泡的存在仍然存在爭議，自2009年Regente等首次從向日葵幼苗分離出并通過透射電子顯微鏡和蛋白質組學分析證實植物外泌體的存在以來，植物外泌體的研究尤其是在醫(yī)學方面并不是很多。目前通過實驗證實存在外泌體的植物尤其是中藥材生姜、胡蘿卜、番茄、生姜、金銀花、紅景天、西蘭花、葡萄、水稻、甘草等。這些食源性植物外泌體被證明具有良好的跨物種交流功能。自然界中藥用植物繁多，探索其外泌體在疾病治療中的作用機制手段和用途具有重要的基礎與臨床研究價值。

四、不同來源的植物外泌體及作用
4.1 生姜          生姜可強化米色脂肪功能，促進代謝，增加機體的胰島素敏感性。Teng等發(fā)現(xiàn)生姜的外泌體樣納米顆粒（gingerexosome-likenanoparticles，GELN）可被腸道細菌攝取，易被乳桿菌吸收，所含的miRNA可直接調控特定細菌的基因表達和代謝物，從而影響菌群組成和宿主生理，增強宿主腸道屏障功能來緩解小鼠的結腸炎。

圖4     生姜

        如上文所述，從生姜中提取的外泌體可以選擇性結合牙齦卟啉單胞菌表面的血紅素結合蛋白35（hemin-bindingprotein35，HBP35）從而影響該菌的生長、附著和遷移，降低該菌的致病性，有效控制慢性牙周炎的發(fā)展。另外，生姜外泌體中的小RNA能作用于腸道菌群，對腸道菌群的組成產生影響，可增加乳桿菌和擬桿菌，減少梭菌數量。生姜外泌體與腸道細菌接觸被吸收，可以調節(jié)細菌某些基因表達和蛋白生成。

4.2 紅景天          Du等發(fā)現(xiàn)，草藥紅景天外泌體HJT-sRNA-m7在體外和小鼠肺組織中均能有效地降低纖維化標志基因和蛋白的表達。植物sRNA可通過脂質復合物途徑進入人體，為口服sRNA作為治療藥物提供了一種創(chuàng)新的治療策略。

圖5       紅景天

4.3 金銀花          甲型流感病毒（influenzaAvirus，IAV），特別是H1N1、H5N1和H7N9，對全世界的公共衛(wèi)生構成了嚴重威脅。Zhou等在研究中報道了金銀花來源的外泌體miRNAMIR2911，在湯劑中高度穩(wěn)定，連續(xù)飲用或灌胃給藥可使小鼠外周血和肺組織MIR2911水平顯著升高，可靶向多種IAV，包括H1N1、H5N1和H7N9，顯著抑制H1N1編碼的PB2和NS1蛋白的表達，顯著抑制H1N1病毒復制，但對突變病毒感染無影響。MIR2911在體內外均能抑制H5N1和H7N9病毒的復制。值得注意的是，服用MIR2911或金銀花湯劑可顯著降低H5N1感染引起的小鼠死亡率。MIR2911是中藥中第一個直接靶向多種IAV的活性成分，有望成為有效抑制病毒感染的新藥。

圖6     金銀花

4.4 甘草          miRNA通過抑制蛋白編碼mRNA的翻譯或促進mRNA降解來調節(jié)蛋白編碼基因的表達。植物miRNA通常是甲基化的，不易降解。甘草干煎劑中含有豐富的miRNA，向靜等利用從甘草水煎劑中提取的小分子RNA以及合成的miRNA模擬物（mimic）作用于分離自健康人的外周血單核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）。結果表明，甘草miRNA可通過抑制T細胞分化、炎癥和凋亡相關基因的表達而顯著調節(jié)PBMC，為全面研究甘草的作用機制和發(fā)展中藥提供了新的思路。

圖7    甘草

4.5 葡萄          Ju等發(fā)現(xiàn)可從碾碎的葡萄中分離出一種類外泌體納米顆粒。這些類外泌體，被小鼠食用后，能躲過各種消化酶的水解，最終到達腸道，加快腸道上皮增殖，促進結腸炎的恢復。 4.6 番茄          吳菊萍等采用多步差速離心法和蔗糖密度梯度法優(yōu)化了番茄外泌體的提取工藝，建立了番茄外泌體負載模型藥物和目的基因的納米藥物，考察了細胞的攝取能力。研究結果表明，番茄外泌體構建的納米藥物對細胞無毒，可被細胞攝取并分布于胞漿，其負載基因能有效降低目的基因的表達水平，因此番茄外泌體成為潛在的藥物載體。 4.7 向日葵          Regente等首先從向日葵幼苗的細胞外液中分離出細胞外囊泡，通過透射電子顯微鏡和蛋白質組學分析表征EV，發(fā)現(xiàn)這些EV可能富含細胞壁重塑酶和防御蛋白，被植物病原真菌核盤菌吸收。EV具有與真菌細胞相互作用和殺滅真菌細胞的能力，植物EV處理的孢子表現(xiàn)出生長抑制、形態(tài)變化和細胞死亡，植物通過EV進行細胞間通訊。 4.8 擬南芥          外泌體是通過運輸蛋白質和sRNA在哺乳動物細胞間信號傳導中發(fā)揮中心作用的EV。眾所周知，植物也會產生EV，尤其是對病原體感染的反應。2017年Rutter等發(fā)現(xiàn)從擬南芥葉片質外體液提取細胞外囊泡的方法，然后對EV進行蛋白質組分析，發(fā)現(xiàn)富集了生物和非生物脅迫應答的相關蛋白。相應地，被丁香假單胞菌感染的植物和水楊酸處理后的植物EV分泌增強。這項發(fā)現(xiàn)表明植物EV在植物免疫過程中發(fā)揮作用。

圖8     擬南芥

五、小結          植物外泌體攜帶蛋白質、脂質、核酸等，可反映來源細胞的生理、病理情況，在細胞間物質交換和信息傳遞中發(fā)揮重要作用。目前研究的植物外泌體大多來源于可食用的植物或草藥，其安全可靠、副作用小，發(fā)揮著抗炎、抗病毒、抗纖維化及抗腫瘤等作用。植物外泌體分離提取、鑒定分析成為目前研究的熱點。另外，納米尺寸的植物外泌體也可作為載體攜帶藥物應用于各種疾病的研究。探討其獨特的生物學結構的生物學意義，不僅為各種疾病提供了一種安全經濟的治療選擇，也為個體生物學治療提供了一種靶向性策略，還能為未來藥物載體的研發(fā)開啟一條全新的思路。 參考文獻：

【1】王莉,李靜鈺,徐銳,等.植物外泌體的研究進展[J].國際藥學研究雜志, 2020, 47(8):5.

【2】陳春蘋,徐紅艷,劉帥辰,等.植物類外泌體樣納米顆粒特性,成分與功能研究進展[J].食品與機械, 2024, 40(1):226-233.

【3】帖慧琳,李春磊,王浩然,等.植物外泌體提取及應用研究進展[J].食品與藥品, 2020, 22(6):6.

【4】陸麒元,孫雯,齊素華,等. 植物外泌體在醫(yī)學應用中的研究進展[J]. 養(yǎng)生保健指南,2021(17):293-294.

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