在生命科學領(lǐng)域，從細胞的精細結(jié)構(gòu)到組織的動態(tài)變化，成像技術(shù)的進步始終推動著生物學研究的邊界。雙光子光片顯微鏡作為一項前沿技術(shù)，以其高分辨率、低光毒性和深層成像能力，在腦神經(jīng)活動監(jiān)測、胚胎發(fā)育追蹤等研究中展現(xiàn)出巨大潛力。然而，傳統(tǒng)技術(shù)中光片厚度與長度的矛盾始終限制著其應用范圍。本文將聚焦于貝塞爾雙光子光片顯微鏡的創(chuàng)新突破，解析其如何通過液晶空間光調(diào)制器實現(xiàn)"無衍射"光束整形，突破傳統(tǒng)成像瓶頸，為活體生物成像開辟全新視野。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
雙光子光片顯微鏡的優(yōu)勢與局限
雙光子光片顯微鏡融合了雙光子激發(fā)的非線性光學效應與光片照明的層切特性，成為活體成像領(lǐng)域的明星技術(shù)。其工作原理基于照明光路與成像光路的正交設計，僅焦平面處的熒光分子被激發(fā)，這種選擇性照明顯著降低了非焦平面的光毒性與光漂白效應。同時，雙光子激發(fā)概率與光強平方成正比，使得激發(fā)區(qū)域高度局域化，進一步提升了軸向分辨率。然而，傳統(tǒng)高斯光束在軸向方向的快速衍射展寬，導致光片長度與厚度難以兼顧——薄光片雖能提高軸向分辨率，但受限于短光片長度，成像視場被極大壓縮；而擴展光片長度則必然犧牲厚度，降低層切效果。這種固有矛盾如同一道技術(shù)天花板，限制了該技術(shù)在大視場高分辨率成像中的應用潛力。

國內(nèi)外技術(shù)演進與瓶頸
為突破這一局限，國際研究團隊曾嘗試多種方案。2015年北京大學陳良怡團隊利用TAG透鏡實現(xiàn)焦點快速掃描，雖在170μm視場內(nèi)取得420nm橫向分辨率，但受限于進口管制，該方案難以在國內(nèi)推廣。2020年UTSouthwestern團隊通過引入額外振鏡系統(tǒng)擴展光片長度，卻因光路復雜性與視場局限性，未能實現(xiàn)真正意義的突破。這些嘗試雖在局部參數(shù)上取得進展，但均未能從根本上解決光片厚度與長度的矛盾，行業(yè)內(nèi)亟需一種既能保持光片超薄特性，又能實現(xiàn)長距離無衍射傳播的創(chuàng)新方案。

技術(shù)創(chuàng)新與應用
貝塞爾光束的"無衍射"特性與調(diào)制原理
貝塞爾光束作為數(shù)學與物理結(jié)合的奇跡，其核心特性在于傳播過程中光強分布保持不變的"無衍射"特性。這種光束由多個平面波相干疊加形成，中心主光瓣周圍環(huán)繞著強度遞減的旁瓣。在雙光子激發(fā)模式下，由于旁瓣強度遠低于主光瓣，僅有中心光束能有效激發(fā)熒光，形成理想的"針狀"光片，完美解決了傳統(tǒng)高斯光束的固有缺陷。

光學系統(tǒng)設計與工程實現(xiàn)
研究團隊構(gòu)建的貝塞爾雙光子光片顯微鏡采用近紅外飛秒激光作為光源，通過擴束器、液晶空間光調(diào)制器及4F透鏡系統(tǒng)，將調(diào)制后的貝塞爾光束精準投射至樣品平面。照明光路與成像光路的正交設計確保了層切效果，而低通濾光片有效屏蔽散射光干擾。該系統(tǒng)創(chuàng)造性地將貝塞爾光束的理論優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為工程實踐，實現(xiàn)了310μm×1.9μm的光片參數(shù)，長度厚度比達到驚人的163:1，突破性地將成像視場擴展至傳統(tǒng)技術(shù)的十倍以上，同時保持亞微米級軸向分辨率。

活體成像的臨床轉(zhuǎn)化潛力
這項技術(shù)的臨床應用前景令人矚目。在神經(jīng)科學領(lǐng)域，其大視場高分辨率特性可實現(xiàn)腦神經(jīng)元網(wǎng)絡的動態(tài)監(jiān)測；在發(fā)育生物學中，能夠追蹤胚胎器官形成過程中的細胞遷移軌跡；對于腫瘤研究，可實時觀察血管生成與腫瘤侵襲邊界。特別值得注意的是，該技術(shù)的低光毒性特性使其適用于長時間活體觀察，為研究細胞行為學提供了前所未有的工具。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，貝塞爾光片顯微鏡不僅提升了成像性能，更拓展了應用場景的邊界，有望成為生物醫(yī)學研究的標準化平臺。

成像實驗與結(jié)果分析
熒光微珠分辨率驗證實驗
研究團隊采用直徑100nm的熒光微珠進行分辨率標定實驗。在瓊脂柱中均勻分布的微珠呈現(xiàn)出規(guī)則的點陣結(jié)構(gòu)，成像結(jié)果表明整個視場內(nèi)微珠亮度均勻、形態(tài)清晰。通過對X、Y方向灰度分布的高斯擬合分析，測得橫向分辨率為440nm，接近理論衍射極限。Z軸方向的層切實驗顯示軸向分辨率為1.88μm，與設計參數(shù)高度吻合。這種三維各向異性分辨率的精確匹配，驗證了貝塞爾光束在保持大視場的同時，能夠維持納米級橫向分辨率與亞微米級軸向分辨率的卓越性能。

活體斑馬魚胚胎成像驗證
以吖啶橙染色的5天齡斑馬魚胚胎為模型，實驗成功捕捉到血液細胞的動態(tài)流動過程。通過對200幀連續(xù)圖像的追蹤分析，測得血液流速為22.6μm/s，驗證了系統(tǒng)的時序分辨率。更令人振奮的是，貝塞爾光束能夠穿透胚胎脊柱，清晰分辨骨細胞形態(tài)并實現(xiàn)自動分割計數(shù)。這種穿透性成像能力突破了組織散射極限，為深層組織的無損觀測提供了可能。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該系統(tǒng)在保持高分辨率的同時，將成像深度提升了2-3倍，為活體胚胎發(fā)育研究提供了全新視角。

總結(jié)與展望
貝塞爾雙光子光片顯微鏡通過液晶空間光調(diào)制器的精密相位調(diào)控，將貝塞爾光束的無衍射特性應用于雙光子激發(fā)，突破了傳統(tǒng)高斯光束在光片長度與厚度上的固有矛盾。實驗驗證表明，該技術(shù)在310μm視場范圍內(nèi)實現(xiàn)了440nm橫向分辨率和1.9μm軸向分辨率，成功解決了長期困擾領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸。熒光微珠實驗驗證了其納米級分辨率，活體斑馬魚胚胎成像展示了其在深層組織穿透和動態(tài)觀測中的卓越性能。

未來，該技術(shù)的發(fā)展將聚焦于軸向分辨率的進一步提升和多模態(tài)成像融合。通過優(yōu)化旁瓣抑制技術(shù)，有望實現(xiàn)各向同性的三維分辨率；結(jié)合光聲成像或超聲層析技術(shù)，可構(gòu)建多維度信息獲取平臺。在臨床轉(zhuǎn)化方面，該技術(shù)有望應用于實時術(shù)中導航、腫瘤微環(huán)境監(jiān)測及神經(jīng)退行性疾病研究等領(lǐng)域。貝塞爾雙光子光片顯微鏡不僅為生命科學研究提供了革命性工具，更可能催生全新研究范式。

DOI:10.37188/CJLCD. 2024-0303.