文獻分享：Protein A層析改進新策略助力解決抗體聚集體去除難題_abio生物試劑品牌網
在抗體純化過程中，聚集體的去除一直是個讓人頭疼的問題，聚集體的存在會嚴重影響產品質量，增加免疫原性風險。
作為抗體純化工藝中最常用的捕獲步驟，Protein A親和層析在抗體捕獲方面具有高效性，能夠有效去除宿主細胞蛋白（HCP）和DNA等工藝相關雜質。
然而，在去除抗體聚集體方面，Protein A親和層析卻存在一定局限。聚集體通常與單體結合更緊密，即便通過調整洗脫pH值，仍難以實現良好的分離。因此，去除聚集體往往依賴于后續的中度純化和精細純化步驟，而較高含量的聚集體可能會對后續純化工藝帶來較大挑戰。
今天我們來聊聊一篇文獻中介紹的新策略，助力您在Protein A純化過程中更有效地去除抗體聚集體。
聚乙二醇（PEG）+氯化鈣/氯化鈉組合研究團隊開發了一種創新方法，顯著提升了Protein A層析去除聚集體的效果。該方法在淋洗和洗脫緩沖液中加入聚乙二醇（PEG）和氯化鈣/氯化鈉組合，通過優化添加濃度，實現了單體和聚集體的幾乎完全分離。
原理解析 PEG對Protein A洗脫峰形的影響
在本研究中，研究者嘗試通過在洗脫緩沖液中加入不同濃度的PEG（1.5%、3%、5%和10%），以觀察PEG對Protein A洗脫曲線的影響。
PEG作為一種廣泛應用于層析的添加劑，通常可以提高單體和聚集體在羥基磷灰石、離子交換和多模式層析柱上的分辨率。這是因為PEG能夠增強蛋白質在這些層析柱上的保留，且這種效應隨著蛋白分子大小的增加而增強。
然而，在Protein A層析柱上，添加高達10%的PEG并未能改善單體和聚集體的分辨率，反而僅僅使目標抗體的保留時間略有增加，洗脫峰變得更尖銳。這一發現解釋了為什么此前文獻中沒有報道在Protein A層析中使用PEG去除聚集體的方法。
氯化鈣對Protein A洗脫峰形的影響
在另一項研究中，研究者發現，在Protein A洗脫緩沖液中加入500mM離液鹽（如氯化鈣和氯化鎂）可以顯著提高異源二聚體和同源二聚體在Protein A柱上的分辨率，并使這兩類抗體在較高pH條件下洗脫。研究者認為，這些離液鹽通過改變抗體與Protein A配基之間的疏水作用，從而提高了填料的選擇性。
基于這一研究，本文進一步探討了氯化鈣在去除聚集體中的潛在應用。研究中比較了不同濃度氯化鈣（250mM、500mM、750mM和1M）對Protein A洗脫峰形的影響。結果顯示，氯化鈣的確能夠在一定程度上改善單體和聚集體的分辨率，且500mM氯化鈣效果最佳。
操作建議研究表明，單純使用PEG作為添加劑并不能有效改善Protein A柱中抗體單體和聚集體的分離效果。而氯化鈣作為添加劑，能通過調整疏水作用提高分辨率，尤其在去除抗體聚集體方面具有較大潛力。
? 在Protein A層析捕獲階段，可嘗試在洗脫緩沖液中加入氯化鈉或氯化鈣，同時配合5%PEG，以改善聚集體去除效果。
? 需根據抗體特性和聚集體含量，調整鹽和PEG的濃度，推薦先進行小試驗證。
? 雖然氯化鈣對分辨率有正面作用，但也可能對蛋白活性造成一定影響，需在實驗中進行條件篩選和參數優化，進行綜合評估。
可優化參數
? PEG濃度范圍：e.g. 1.5%、3%、5%、10%
? 氯化鈣濃度范圍：e.g. 250mM、500mM、750mM、1M
? 氯化鈉濃度范圍：e.g. 250mM、500mM、600mM、750mM
? 在本文案例中，以500mM氯化鈣或750mM氯化鈉和5%PEG組合效果最佳，分離效果顯著提升。
方法優勢
顯著提升去除效果
? 通過向洗脫緩沖液中添加500mM氯化鈣和5%PEG，洗脫液中的聚集體含量從20%降至3%~4%。
? PEG和氯化鈣/氯化鈉在合適濃度下表現出顯著的協同作用，改善單體與聚集體的分離效果。
提升工藝穩健性? 該方法通過在Protein A捕獲階段減少聚集體含量，降低了后續精細純化的壓力，提升整體純化工藝的穩健性。
小結通過在Protein A層析洗脫液中添加PEG和氯化鈣/氯化鈉組合，可以顯著提升聚集體去除效果，同時保持抗體高回收率。該方法操作簡便，可直接應用于現有工藝中，為抗體純化工藝的優化提供了新思路。
參考文獻
[1] Yuan Zhang et al., A method for improving protein A chromatography's aggregate removal capability, Protein Expression and Purification 158 (2019) 65–73.
本站“ABIO生物試劑品牌網”圖片文字來自互聯網
如果有侵權請聯系微信: nanhu9181 處理，感謝~
