CAR-T療法自2012年首次成功應(yīng)用以來(lái)，已為數(shù)萬(wàn)名患者提供了治療機(jī)會(huì)，其中大部分患者實(shí)現(xiàn)了臨床獲益，有的患者能夠長(zhǎng)期生存甚至臨床治愈。CAR-T療法顯著改善了血液惡性腫瘤患者的生存質(zhì)量，并在實(shí)體瘤領(lǐng)域展現(xiàn)了強(qiáng)勁的治療潛力。但傳統(tǒng)的CAR-T療法存在生產(chǎn)方法復(fù)雜、生產(chǎn)成本高昂以及細(xì)胞因子釋放綜合征和致瘤性等風(fēng)險(xiǎn)，這些因素嚴(yán)重阻礙了CAR-T療法惠及更廣泛的患者群。

mRNA是一種可以在細(xì)胞中快速表達(dá)功能性蛋白而無(wú)需基因整合的潛在治療制劑，但目前的mRNA遞送載體（如脂質(zhì)納米顆粒）存在T細(xì)胞攝取能力差和內(nèi)體逃逸效率低的問(wèn)題。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種能夠在體內(nèi)特異性和高效地將mRNA遞送到T細(xì)胞中的新型遞送載體。

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）是一種由包膜、衣殼和RNA組成的RNA病毒，能夠特異性感染人類CD4+T細(xì)胞。HIV的包膜糖蛋白gp160能夠識(shí)別T細(xì)胞上的CD4分子，從而促進(jìn)病毒包膜與T細(xì)胞膜的融合，使得由衣殼蛋白裝載的基因組RNA能夠被直接遞送至T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而繞過(guò)了內(nèi)吞途徑。此外，有研究表明，一種突變的gp160能夠靶向CD4+和CD8+T細(xì)胞，擴(kuò)展了對(duì)不同T細(xì)胞亞群的靶向潛力。因此，HIV作為一種具有獨(dú)特遞送方式的天然的RNA藥物載體，通過(guò)細(xì)胞靶向膜融合機(jī)制，能夠特異且高效地將RNA遞送至T細(xì)胞中。

2025年3月11日，華南理工大學(xué)王均教授和許從飛副教授團(tuán)隊(duì)在Cell Biomaterials上發(fā)表了題為“Leveraging T cell-specific fusogenicity of HIV for in vivo mRNA delivery to produce human CAR-T cells”的研究論文。該研究通過(guò)模擬HIV的膜融合機(jī)制，開(kāi)發(fā)了一種T細(xì)胞特異性膜融合病毒樣顆粒（T-FVLPmCAR），能夠高效地將CAR mRNA遞送到T細(xì)胞中，在體內(nèi)直接生成CAR-T細(xì)胞。小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示，T-FVLPmCAR能夠在體內(nèi)生成足夠的CAR-T細(xì)胞并有效治療B細(xì)胞淋巴瘤，且不會(huì)引發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合征及神經(jīng)毒性等副作用，從而為CAR-T療法提供了一種可擴(kuò)展的、更安全的替代方案。

一、T-FVLP的設(shè)計(jì)與表征
為了開(kāi)發(fā)一種能夠特異性與T細(xì)胞膜融合的病毒樣顆粒（T-FVLP），研究者對(duì)293TB2M－/－細(xì)胞和編碼突變型gp160包膜糖蛋白及Peg10衣殼蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，成功制備了T-FVLP。透射電子顯微鏡圖像顯示，T-FVLP為直徑97.2 nm的球形顆粒，具有良好的單分散性（圖1B, C）。通過(guò)納米流式檢測(cè)儀（Flow NanoAnalyzer）測(cè)定T-FVLP的顆粒數(shù)量，結(jié)果表明每1×107個(gè)293TB2M－/－細(xì)胞可以產(chǎn)生1.5×109個(gè)T-FVLP顆粒。Western blot分析進(jìn)一步確認(rèn)了T-FVLP具有突變型gp160和Peg10蛋白成分（圖1D）。為了驗(yàn)證T-FVLP與T細(xì)胞膜的融合能力，研究者將標(biāo)記了DiD染料的T-FVLP與人類外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）共孵育，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，T-FVLP能夠特異性地與T細(xì)胞膜融合，使34.6%的CD3＋T細(xì)胞表現(xiàn)出DiD的陽(yáng)性信號(hào)，顯著高于野生型gp160組成的VLP對(duì)照組（2.7%）（圖1E-K）。此外，如果在T-FVLP與T細(xì)胞孵育時(shí)加入gp160抑制劑enfuvirtide，融合效率顯著降低，證實(shí)了突變型gp160在T-FVLP與T細(xì)胞膜融合中的關(guān)鍵作用（圖1L, M）。上述結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了能夠特異性地與CD4+和CD8+T細(xì)胞膜融合的T-FVLP，為后續(xù)的CAR mRNA遞送和CAR-T細(xì)胞生成提供了高效的載體。

圖1. T-FVLP的構(gòu)建與表征

二、體外驗(yàn)證T-FVLPmCAR的遞送效率
通過(guò)將293TB2M－/－細(xì)胞與編碼突變型gp160包膜糖蛋白、Peg10衣殼蛋白和αhCD19 mRNA共轉(zhuǎn)染制備T-FVLPmCAR。研究者隨后利用納米流式檢測(cè)儀在單顆粒水平檢測(cè)CAR mRNA的裝載效率。結(jié)果顯示，幾乎所有T-FVLPmCAR顆粒都裝載了CAR mRNA（圖2B），每個(gè)顆粒可裝載高達(dá)9.5 ng的CAR mRNA。這表明T-FVLPmCAR具有高效裝載mRNA的能力。

隨后，研究者將T-FVLPmCAR與T細(xì)胞共孵育，結(jié)果顯示，25.6%的CD3＋T細(xì)胞成功表達(dá)了CAR蛋白（圖2C），這表明T-FVLPmCAR能夠?qū)AR mRNA高效地遞送到T細(xì)胞中，并在細(xì)胞內(nèi)成功翻譯為功能性CAR蛋白。進(jìn)一步的功能驗(yàn)證顯示，這些CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19＋腫瘤細(xì)胞具有顯著的特異性殺傷能力（圖2H-K）。此外，CAR-T細(xì)胞的生成具有瞬時(shí)性，CAR表達(dá)在48小時(shí)后顯著下降（圖2F-J）。這種瞬時(shí)性有助于降低細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome, CRS）的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，T-FVLPmCAR能夠在體外高效地將CAR mRNA遞送到T細(xì)胞中，并生成具有抗原特異性細(xì)胞毒性的CAR-T細(xì)胞。

圖2. T-FVLPmCAR通過(guò)T細(xì)胞特異性膜融合產(chǎn)生αhCD19 CAR-T細(xì)胞

三、體內(nèi)原位生成CAR-T細(xì)胞
為了進(jìn)一步驗(yàn)證T-FVLPmCAR是否能夠在體內(nèi)將CAR mRNA高效地遞送到T細(xì)胞中，并在體內(nèi)原位生成CAR-T細(xì)胞。研究者通過(guò)尾靜脈注射DiD標(biāo)記的T-FVLP和T-FVLPmCAR到免疫人源化NCG小鼠體內(nèi)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，T-FVLP能夠特異性地與循環(huán)T細(xì)胞發(fā)生膜融合，使5.5%的CD3＋T細(xì)胞表現(xiàn)出DiD陽(yáng)性信號(hào)，而B(niǎo)細(xì)胞和髓系細(xì)胞中幾乎未檢測(cè)到融合信號(hào)（圖3A-F），這表明T-FVLP在體內(nèi)具有高度的T細(xì)胞靶向性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，T-FVLPmCAR能夠?qū)?.2%的循環(huán)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為αhCD19 CAR-T細(xì)胞，且在非T細(xì)胞中未檢測(cè)到CAR表達(dá)（圖3G-L），證實(shí)了T-FVLPmCAR在體內(nèi)生成CAR-T細(xì)胞的特異性和高效性。

圖3. 通過(guò)T-FVLPmCAR在體內(nèi)構(gòu)建αhCD19 CAR-T細(xì)胞

四、腫瘤治療療效和安全性
在免疫人源化NCG小鼠模型中，研究者評(píng)估了T-FVLPmCAR對(duì)Raji-Luc B細(xì)胞淋巴瘤的治療效果和安全性。小鼠被植入Raji-Luc B細(xì)胞淋巴瘤后接受T-FVLPmCAR治療。結(jié)果顯示，T-FVLPmCAR顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤抑制率高達(dá)83.5%~99.0%，且在高劑量下部分小鼠實(shí)現(xiàn)了腫瘤完全消退（圖4B-E）。

在安全性方面，治療后小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子水平未顯著升高，體重?zé)o明顯變化，表明治療未引起明顯的全身性炎癥反應(yīng)或?qū)π∈笳w健康產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，通過(guò)組織病理學(xué)分析，研究者未在小鼠的主要器官（如心、肝、肺、腎和腦）中發(fā)現(xiàn)明顯的組織損傷或神經(jīng)毒性（圖4F-L），這些結(jié)果表明，T-FVLPmCAR不僅在治療B細(xì)胞淋巴瘤方面表現(xiàn)出顯著的療效，還具有良好的生物相容性和安全性。

圖4. T-FVLPmCAR治療B細(xì)胞淋巴瘤且不引發(fā)明顯副作用

總結(jié)
本研究巧妙地模擬HIV的膜融合機(jī)制，成功開(kāi)發(fā)出T-FVLPmCAR——一種能精準(zhǔn)向T細(xì)胞遞送CAR mRNA的創(chuàng)新載體。這種策略不僅提升了CAR mRNA的遞送效率，在體內(nèi)高效生成CAR-T細(xì)胞，并有效地抑制了B細(xì)胞淋巴瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)避免了傳統(tǒng)CAR-T療法的常見(jiàn)副作用。該成果為CAR-T療法開(kāi)辟了一種更安全、高效的體內(nèi)生產(chǎn)方法，有很大希望可拓展其臨床應(yīng)用范圍，為癌癥治療帶來(lái)新的曙光。

展望
納米流式檢測(cè)儀（NanoFCM）不僅可以在單顆粒水平分析T-FVLPmCAR粒徑及其分布、顆粒濃度，同時(shí)可對(duì)VLP顆粒的常見(jiàn)的生化組分（核酸、包膜蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白等）進(jìn)行單一組分鑒定和不同組分之間的共定位分析，實(shí)時(shí)優(yōu)化工藝流程，提高產(chǎn)品的純度和成品率。這種一機(jī)多能的表征方案，不僅可助力CAR-T產(chǎn)業(yè)降本增效，更將在細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域的病毒表征中大放異彩，為行業(yè)的發(fā)展添磚加瓦。