Mechanoreceptor PIezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation

Keywords: CREB; Conjunctival epithelial cells; Inflammation; Mechanical stress; Neutrophils; Piezo1; p38 MAPK.

據報道，揉眼睛會顯著惡化各種眼部疾病。長期過度揉眼時對角膜產生的機械壓力導致角膜變薄，這種情況稱為圓錐角膜。許多研究強烈表明，圓錐角膜可能是一種炎癥性疾病。眼部炎癥是一種多方面的反應，通常由各種刺激物引發。常見的過敏原和病原體，如花粉、寵物皮屑、真菌、塵螨和病毒，以及煙霧和化學物質等環境刺激，都會在眼表引發免疫反應。

圓錐角膜患者和佩戴隱形眼鏡人群的淚液研究（隱形眼鏡被認為會對眼表組織產生機械應力）已經確定了促炎細胞因子水平的升高，如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和基質金屬蛋白酶-9 （MMP-9）。重要的是，研究已經證明，揉眼本身會急性誘導正常受試者淚液中IL-6、IL-8 和 TNF-α 等細胞因子的釋放，這些細胞因子在眼表炎癥中起著至關重要的作用。因此，由摩擦眼睛和佩戴隱形眼鏡引起的機械應力有可能通過激活機械敏感離子通道在眼表誘導炎癥反應。

Piezo蛋白家族之一，Piezo1 主要在非神經元組織中表達，可以感知各種應力，包括壓應力、拉伸應力和剪切應力等，并參與調控血管發育、血管收縮、紅細胞體積等諸多生理過程。最近的研究報道表明，Piezo1 通道通過誘導機械應力驅動的細胞因子產生，與炎癥反應和各種病理狀況有關，突出了它們在機械感覺之外的作用。然而，Piezo1 在眼部組織中的功能及其與眼部炎癥的關系仍不清楚。

近日，日本昭和大學醫學研究生院生理學系及眼科系課題組在最新研究中闡明了機械應力可誘導或加重眼部炎癥這一先前懷疑但尚未明確的現象，并重點關注了 Piezo1 通道在結膜上皮細胞中的作用及其潛在機制。研究成果發表于 The Ocular Surface 期刊題為“Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation”。
首先，檢查了機械敏感的 Piezo1 通道的激活是否會改變炎性細胞因子的表達。將Piezo1 特異性激動劑 Yoda1 和幾種過敏原應用于培養的人結膜上皮細胞（HConjECs），發現 Yoda1 明顯將 HConjECs 中的 IL-6 和 IL-8 mRNA 水平提高到與真菌提取物 （Alternaria alternata）誘導的水平相似。在誘導白細胞介素表達的藥物中，Yoda1 和真菌提取物都激活了信號蛋白 p38 MAPK 和轉錄因子 CREB。這些數據表明，機械敏感的 Piezo1 通道的激活可以在 HConjECs 中誘導炎性細胞因子，如 IL-6 和 IL-8，其水平與真菌提取物通過常見的細胞內信號通路誘導的水平相似。

然后，確定功能性 Piezo1 通道是否在 HConjECs 中表達。RT-PCR 和 Western blot 分析清楚地表明 HConjECs 表達 Piezo1 通道。細胞內 Ca2+ 的成像顯示，在 Yoda1 刺激 Piezo1 通道后，[Ca2+]i立即顯著增加。與 IL-6 表達和 p38 MAPK/CREB 的激活相同，在測試的過敏原中，只有真菌提取物誘導 [Ca2+]i 顯著升高，進一步支持其是共享信號通路。這表明，HConjECs 表達一個功能性機械敏感的 Piezo1 通道，該通道在介導細胞內 Ca2+ 信號傳導和炎癥反應中起關鍵作用。

為了證實通過Piezo1通道和p38 MAPK和CREB激活的 Ca2+ 內流參與IL-6上調，使用p38 MAPK 特異性抑制劑 SB203580 和 Ca2+ 螯合劑預處理 HConjECs，發現SB203580 成功阻斷了p38 MAPK 的激活（圖1 A、B）。重要的是，阻斷 p38 MAPK 激活顯著抑制了 Piezo1 通道激活誘導的 CREB 激活（圖1 A-C）和 IL-6 蛋白/mRNA 上調（圖1 D、E）。此外，BAPTA-AM 通過螯合細胞內Ca2+ 顯著降低了 Yoda1 誘導的 IL-6 mRNA 上調（圖1 F）。這些數據表明，活化的 Piezo1 通道通過 Ca2+ 內流和 p38 MAPK-CREB 通路的激活來誘導 IL-6 表達。

圖1 p38 MAPK 的激活和 [Ca2+]i 的升高對 Yoda1 誘導的 IL-6 上調至關重要。

免疫細胞化學分析顯示，p38 MAPK 和 CREB 在 Yoda1 處理后 15 分鐘被顯著激活（磷酸化），并在 HConjECs 的細胞核中發現（圖2 A、B）。在 Piezo 通道激活后 6 小時，還觀察到 IL-6 蛋白表達細胞激增（圖2 C）。IL-6 的免疫反應性與順式高爾基體標志物 GM130 共定位（圖2 D），這種共定位表明，觀察到的 IL-6 蛋白是響應 Yoda1 刺激新合成的。SB203580 預處理后，p38 MAPK 和 CREB 的激活以及IL-6 蛋白的表達明顯減少（圖2 A、B、C）。這些數據表明，Piezo1 通道的激活誘導 p38 MAPK 磷酸化及易位到細胞核，隨后刺激 CREB 激活和 IL-6 上調。

接下來，為了確認 Piezo1 在 Yoda1 誘導的信號傳導中的功能作用，敲低 HConjECs 中 Piezo1 的表達。結果表明，Yoda1 處理對照細胞中 [Ca2+]i升高及 p38 MAPK 和 CREB 磷酸化，這在 PIEZO1 敲低細胞中被顯著抑制。此外，PIEZO1 敲低顯著降低了 Yoda1 誘導的 IL-6 mRNA 表達的上調。這些數據表明，HConjECs 中Yoda1 誘導的 [Ca2+]i 升高、細胞核 p38 MAPK/CREB 激活和 IL-6 上調嚴重依賴于 Piezo1。

圖2 Piezo1 激活顯著誘導 HConjECs 中磷酸化-p38 MAPK 和磷酸化-CREB 的核表達以及 IL-6 蛋白的胞質表達，這嚴重依賴于 p38 MAPK 激活。

進一步地，實驗確定了機械刺激是否真的導致了 Yoda1 依賴性 Piezo1 通道激活誘導的現象。將培養的 HConjECs 拉伸至 120 %，發現拉伸刺激誘導 p38 MAPK-CREB 通路在沒有Yoda1處理的情況下以細胞外 Ca2+ 依賴的方式激活（圖3 B、C）。在 HConjECs 中拉伸刺激 6 小時后也證實了 IL-6 上調，其被SB203580 阻斷（圖3 D）。GsMTx4 是一種機械敏感的離子通道抑制劑，可顯著抑制拉伸誘導的 p38 MAPK、CREB 的激活和 IL-6 mRNA 表達，但未完全抑制這些反應（圖3 E-H）。這些數據表明，HConjECs 中機械刺激通過 [Ca2+]i 升高和 p38 MAPK/CREB 激活誘導IL-6表達。

圖3 機械拉伸刺激誘導 HConjECs 中 p38 MAPK/CREB 激活和 IL-6 上調。

最后，實驗旨在確定大鼠結膜上皮中 Piezo1 受體的激活是否顯示出與體外培養的 HConjECs 中觀察到的現象相似。將 Yoda1 滴注到眼睛 5-10 分鐘后，觀察到大鼠結膜上皮中磷酸化-p38 和磷酸化-CREB 的表達顯著增加。Piezo1 通道激活后 3 小時，IL-6 免疫反應性也顯著增加。這些數據證實，Piezo1 激活上調大鼠結膜上皮中的 p-p38 MAPK、p-CREB 和 IL-6水平，與體外培養的 HConjECs 現象相似。

此外，還觀察到大鼠結膜上皮中 Piezo1 受體刺激后 24 小時，中性粒細胞、髓過氧化物酶（MPO）陽性細胞的數量顯著增加。然而，在將 Yoda1 滴注到眼睛后 3 小時和 24 小時，嗜酸性粒細胞主要堿性蛋白（MBP）陽性細胞的數量沒有變化。這些數據表明，結膜中 Piezo1 通道的激活誘導中性粒細胞浸潤到結膜上皮細胞，而不影響嗜酸性粒細胞浸潤。

圖4 圖形概要

機械敏感的 Piezo1 通道的激活通過升高 [Ca2+]i 以及 p38 MAPK 和轉錄因子 CREB 的激活誘導結膜上皮細胞中IL-6的表達。機械應力通過它刺激 Piezo1 通道和 Ca2+ 內流，誘導 p38 MAPK 的激活。轉錄因子 CREB 在 p38 MAPK 激活后被磷酸化，然后促進 IL-6 轉錄。

幾乎每個人都知道我們不應該揉眼睛，并經常把這個建議歸因于不干凈的手指有感染的風險或對眼表存在潛在損害。然而，該研究表明，揉眼可以誘導結膜中炎性細胞因子的產生，導致中性粒細胞浸潤。中性粒細胞浸潤的結果以及 Piezo1 激活后觀察到的細胞反應與真菌暴露引發的結果相似，這表明結膜的機械刺激可以引發類似于感染的炎癥反應。這意味著感染引起的眼癢可能會促使揉眼，從而增強炎癥防御機制。然而，該研究與其他研究的結果表明，習慣性揉眼或過敏癥狀引起的過度揉眼會導致過度活躍的炎癥反應，增加患上或加劇眼部炎癥或炎癥相關疾病（如圓錐角膜）的風險。因此，提高對持續揉眼風險的認識對于預防眼部炎癥的發生和進展至關重要。

參考文獻：Fukuoka S, Adachi N, Ouchi E, Ikemoto H, Okumo T, Ishikawa F, Onda H, Sunagawa M. Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation. Ocul Surf. 2025 Jan 6;36:56-68. doi: 10.1016/j.jtos.2025.01.001. Epub ahead of print. PMID: 39778715.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39778715/

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