ChIP-seq等技術(shù)揭示突變在癌癥中的H3K36甲基化新型表觀遺傳治療靶點_abio生物試劑品牌網(wǎng)
SETD2（SET domAIn containing 2）是哺乳動物中唯一負(fù)責(zé)催化H3K36me3（histone 3,
lysine 36,tri-methylation）蛋白的表觀遺傳因子。H3K36me3在RNA剪接、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，SETD2突變與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）中，SETD2突變與不良預(yù)后相關(guān)。然而，SETD2功能喪失型突變的靶向治療一直是一個挑戰(zhàn)。
近日，美國梅奧診所分子藥理學(xué)和實驗治療學(xué)系Keith D. Robertson團(tuán)隊聯(lián)合美國南卡醫(yī)科大學(xué) (MUSC) Hollings癌癥中心Thai H. Ho，合作探索了SETD2功能喪失型突變在癌癥中的作用機(jī)制，并尋找靶向這種突變的新型表觀遺傳靶向治療方法。研究通過一系列的實驗，包括基因組范圍內(nèi)的合成致死（synthetic lethal, SL）篩選、基因編輯、表觀遺傳分析（ChIP-seq）和藥物驗證等，揭示了SETD2缺失細(xì)胞對NSD1（nuclear receptor-binding SET domain protein 1）介導(dǎo)的H3K36甲基化具有特有敏感性，并提出了基于表觀遺傳修飾的個性化治療策略。相關(guān)研究成果以《SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to ePIgenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation》為題發(fā)表于《Genome Biology》期刊。
標(biāo)題：SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation（SETD2功能喪失型突變使細(xì)胞對NSD1介導(dǎo)的H3K36甲基化的表觀遺傳靶向治療具有獨特敏感性）
期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq等
本研究首先采用了一種無偏倚的全基因組范圍的合成致死篩選方法，鑒定出另一個H3K36me 的writer因子NSD1是SETD2突變細(xì)胞中的合成致死（SL）修飾因子，并在小鼠和人類的同源透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和永生化腎上皮細(xì)胞系中驗證了這種合成致死相互作用。通過CRISPRi靶向方法耗盡NSD1，會促進(jìn)SETD2突變細(xì)胞丟失，同時伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。但只有抑制NSD1（非其他相關(guān)H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶）才會在這些模型中促進(jìn)合成致死性。分別對NSD1和NSD2的基因組H3K36me2靶向進(jìn)行作圖，揭示了這些表觀遺傳writer因子的特異性功能。此外研究還通過使用BT5（一種靶向NSD1的首創(chuàng)藥物抑制劑）重現(xiàn)這種合成致死表型進(jìn)行概念驗證，表明了靶向這種合成致死相互作用的治療可行性。
本研究將全基因組篩選方法與最新的遺傳和藥理學(xué)建模方法相結(jié)合，揭示了一種全新的表觀遺傳方法，用于靶向癌癥中具有挑戰(zhàn)性的SETD2功能喪失突變進(jìn)行個性化治療。
研究方法
合成致死篩選：研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)在SETD2野生型和突變型的HAP1細(xì)胞系中進(jìn)行基因組范圍的篩選，尋找與SETD2缺失具有合成致死關(guān)系的基因。
基因編輯和細(xì)胞模型構(gòu)建：通過CRISPR/Cas9技術(shù)，研究者在多種細(xì)胞系中構(gòu)建了SETD2野生型和突變型的同源細(xì)胞模型，包括ccRCC細(xì)胞系786-O和A498，以及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）。
表觀遺傳分析：研究者利用ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測序）技術(shù)分析了H3K36me2和H3K36me3在基因組上的分布情況，以了解SETD2缺失對組蛋白修飾的影響。
藥物驗證：研究者使用BT5（一種針對NSD1的小分子抑制劑）驗證了通過藥物抑制NSD1是否能夠模擬基因敲除NSD1的合成致死效應(yīng)。
結(jié)果圖形
（1）CRISPR/Cas9篩選揭示NSD1是SETD2突變?nèi)撕托∈蠹?xì)胞中的合成致死（SL）修飾因子
通過CRISPR/Cas9篩選，研究者發(fā)現(xiàn)NSD1是SETD2缺失細(xì)胞的合成致死修飾因子。在SETD2突變的細(xì)胞中，NSD1缺失會導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降，伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。
圖1：全基因組篩選鑒定NSD1為SETD2缺失細(xì)胞中的潛在SL修飾因子。
A. 對同源SETD2野生型/突變型HAP1細(xì)胞中整體H3K36甲基化狀態(tài)的Western blot分析。
B. CRISPR/Cas9合成致死篩選的示意圖。
C. 火山圖突出顯示NSD1為合成致死靶點。
D. 對篩選出的127個SL候選基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)在參與表觀遺傳重塑和DNA損傷/修復(fù)因子中富集。
E. 基因視圖示意圖，展示通過Cre-lox切除第6外顯子實現(xiàn)MEFs中Setd2的誘導(dǎo)性缺失。
F. PCR基因分型確認(rèn)在Setd2flox/flox親本和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細(xì)胞系中他莫昔芬（tamoxifen）誘導(dǎo)的Cre活性。
G. Setd2flox/flox和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細(xì)胞系經(jīng)4-OHT處理后結(jié)晶紫染色。
（2）通過基因組編輯驗證新型SETD2同源/缺失ccRCC模型
SETD2功能缺失突變在多種不同的癌癥類型中很常見，但在ccRCC中最常見，其中SETD2缺失促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。因此研究人員選擇ccRCC細(xì)胞系786O和A498作為模型，以進(jìn)一步探究NSD1在驅(qū)動SETD2突變體SL中的作用。
圖2：同源SETD2突變的失活/激活功能模型在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）中的應(yīng)用
A. 基因組示意圖突出顯示A498細(xì)胞系中SETD2的內(nèi)源性突變以及用于通過同源重組（HR）修復(fù)2個核苷酸缺失的基因組編輯策略。
B. 在HR和Cre介導(dǎo)的選擇載體（selection cassette）切除后，對“修復(fù)”的A498（SET-HDR）細(xì)胞系進(jìn)行PCR基因分型。
C. 通過Sanger測序色譜圖確認(rèn)A498 SET-HDR細(xì)胞系中“TG”缺失的修復(fù)。
D. 在4×放大倍數(shù)下，對A498親本和SET-HDR細(xì)胞系進(jìn)行明場形態(tài)學(xué)評估。
E. 對源自A498和786-O ccRCC細(xì)胞系的SETD2功能正常/缺失細(xì)胞系進(jìn)行整體H3K36甲基化狀態(tài)的Western blot分析。
F. 通過ChIP-seq揭示的A498 SET-HDR和FLAG-SETD2拯救系中H3K36me3增加的火山圖。
G. A498親本、SET-HDR和FLAG-SETD2系中H3K36me3峰的標(biāo)簽密度圖。
H. 對應(yīng)于A498和786O ccRCC細(xì)胞系的野生型、SETD2突變和拯救細(xì)胞系中H3K36me3 peaks的基因水平視圖。
（3）轉(zhuǎn)錄組學(xué)/表觀基因組分析揭示H3K36me2在SETD2突變細(xì)胞中的潛在補(bǔ)償作用
表觀基因組（ChIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）揭示SETD2缺失導(dǎo)致H3K36me3整體性丟失，而H3K36me2在基因組上的分布發(fā)生了顯著變化，特別是在SETD2缺失的細(xì)胞中，H3K36me2增加可能作為一種補(bǔ)償機(jī)制來維持基因組的穩(wěn)定性。
圖3：SETD2/H3K36me3丟失導(dǎo)致的表觀遺傳重組增加了H3K36me2標(biāo)記的普遍性
A-C. MA圖展示A498、786O和RPTEC同源模型中SETD2突變的差異基因表達(dá)。
D. A498、786O、RPTEC同源模型中SETD2突變及一組TCGA-KIRC的SETD2野生型/突變樣本的差異基因表達(dá)GSEA通路熱圖。
E. ccRCC模型中與干擾素信號和PD-1信號相關(guān)的SETD2依賴性調(diào)控的重疊GSEA富集圖。
F.在FLAG-SETD2拯救后，786-O突變細(xì)胞與野生型細(xì)胞（x軸）中差異表達(dá)基因逆轉(zhuǎn)（y軸）相關(guān)性圖。紅點表示在A498同源模型中觀察到的共有差異表達(dá)。
G. SETD2突變同源模型H3K36me3丟失peaks(黑色)和H3K36me2增加peaks(金色)火山圖。
H. A498和786O同源ccRCC中基因水平的H3K36me3(黑色)和H3K36me2(金色)peaks視圖。
(4) ccRCC細(xì)胞系通過CRISPRi抑制NSD1（而非NSD2或NSD3）能夠重現(xiàn)SETD2突變的SL表型
圖4:使用dCas9-KRAB急性耗竭NSD家族成員證實了與NSD1缺失相關(guān)的SL表型
A. 在表達(dá)dCas9-KRAB的SETD2野生型/突變型786-O細(xì)胞系中，通過qRT-PCR分析詳細(xì)說明各個NSD因子的特異性耗竭情況。
B. 在786-O野生型細(xì)胞中，通過CRISPRi耗竭各個NSD因子后，對整體H3K36甲基化狀態(tài)進(jìn)行Western blot分析。
C. 評估在CRISPRi耗竭靶因子后細(xì)胞的相對適應(yīng)性的細(xì)胞競爭/譜系追蹤實驗示意圖。
D. 在786-O野生型和突變型CRISPRi細(xì)胞系中，NSD1耗竭（左）、NSD2耗竭（中）和NSD3耗竭（右）細(xì)胞的相對貢獻(xiàn)。
E. 在CRISPRi耗竭NSD1、NSD2和NSD3后，786-O和A498同源細(xì)胞系的集落形成實驗。
F. 集落形成實驗的定量分析。
（5）DNA損傷和凋亡是SETD2突變型SL表型的基礎(chǔ)
為了闡明SL表型背后的細(xì)胞效應(yīng)，研究人員在ccRCC同基因模型中進(jìn)行RNA-seq以定義SL的基因特征。
圖5：轉(zhuǎn)錄組分析揭示了與DNA損傷和凋亡相關(guān)的SL基因特征
A. 揭示A498和786-O同源模型中SL基因特征的轉(zhuǎn)錄組方法示意圖。
B. A498親本和SET-HDR細(xì)胞系的RNA-seq的主成分分析（PCA）圖，這些細(xì)胞系經(jīng)過sgCTRL、sgNSD1和sgNSD2轉(zhuǎn)導(dǎo)和選擇。
C. A498親本/sgNSD1樣本與A498親本/sgCTRL + A498 SET-HDR/sgNSD1（SETD2/NSD1雙敲除與剩余）之間的差異基因表達(dá)MA圖以揭示與模型相關(guān)的SL基因。
D. A498和786-O SL基因集的GSEA通路熱圖。
E. A498和786-O SL樣本中與凋亡和細(xì)胞防御相關(guān)信號的增強(qiáng)GSEA富集圖。
F. A498和786-O SL基因集中共同上調(diào)和下調(diào)的基因維恩圖。
G. 特異性耗竭NSD1、NSD2和NSD3的A498和786-O同源系中，相對caspase 3/7活性。
H. 在CRISPRi耗竭NSD1后，786-O突變細(xì)胞中caspase 3/7活性的升高FACs圖。
I. 在CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，786-O野生型和突變細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂標(biāo)記物γ-H2AX以及caspase 3/7活性FACs染色分析。
（6）差異性H3K36me2靶向突出NSD1和NSD2的不同活性
研究發(fā)現(xiàn)，盡管NSD1和NSD2都能催化H3K36me2，但它們在基因組上的作用位點和功能存在顯著差異。NSD1主要靶向增強(qiáng)子區(qū)域，而NSD2主要靶向基因體區(qū)域。
圖6：NSD1和NSD2的分子活性差異揭示其在指導(dǎo)SETD2突變SL中的不同活性
A. 786-O野生型細(xì)胞通過CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后H3K36me2標(biāo)記的差異性ChIP-seq結(jié)果火山圖。NSD1特異性peaks（紫色）；NSD2特異性peaks（金色）；共有peaks（黑色）。
B. 在786-O野生型細(xì)胞中，對NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks進(jìn)行ChromHMM建模，對比H3K36me3、H3K36me2、H3K27ac、H3K27me2、H3K27me3和H3K4me1。
C. DeepTools分析NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks及其對H3K36me3相互調(diào)控。
D. NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2與H3K4me1和H3K36me3的重疊情況標(biāo)簽密度圖。
E. A498親本細(xì)胞中sgNSD1與sgNSD2的差異基因表達(dá)MA圖。
F. A498親本細(xì)胞CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，與SL基因CD82和IL6對應(yīng)的基因位點上H3K36me2 peaks（金色）的基因水平視圖。陰影區(qū)域表示NSD1特異性H3K36me2丟失。
（7）SETD2突變的ccRCC細(xì)胞系對NSD1的藥理抑制敏感
使用BT5抑制NSD1能夠模擬NSD1基因敲除效應(yīng)，SETD2突變細(xì)胞對BT5表現(xiàn)出更高的敏感性，這為開發(fā)靶向SETD2突變癌癥的表觀遺傳治療提供了有力的證據(jù)。
圖7：使用BT5抑制NSD1重現(xiàn)SETD2突變SL的遺傳模型
A. 為評估在特定抑制劑處理下，共培養(yǎng)中SETD2野生型/突變型細(xì)胞的相對適應(yīng)性，使用活細(xì)胞顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞競爭/譜系追蹤實驗。
B. 在SETD2功能正常細(xì)胞的共培養(yǎng)中，經(jīng)不同濃度BT5處理后，SETD2突變型786-O（左）和A498（右）的相對貢獻(xiàn)。
C. 786-O和A498同源細(xì)胞系在不同濃度BT5處理下的藥代動力學(xué)分析。
D. 經(jīng)不同濃度BT5處理3天后，整體H3K36甲基化水平的Western blot分析。
E. 經(jīng)5μM BT5（藥理學(xué)）處理或通過CRISPRi耗竭NSD1（遺傳學(xué)）處理的786-O SETD2突變細(xì)胞中差異表達(dá)基因的重疊情況維恩圖。
F. 比較BT5藥理學(xué)抑制和CRISPRi抑制之間共有差異表達(dá)基因相關(guān)性圖。
G. 在SETD2突變和H3K36me3（藍(lán)色）丟失下，NSD1介導(dǎo)的H3K36me2（黃色）在維持基因組保真度中的補(bǔ)償作用模型圖。
易小結(jié)
本研究揭示了SETD2缺失細(xì)胞對NSD1介導(dǎo)的H3K36甲基化的特有敏感性，并提出了通過靶向NSD1來治療SETD2突變癌癥的新策略。研究結(jié)果不僅增進(jìn)了對SETD2在癌癥中作用機(jī)制的理解，還為開發(fā)新型表觀遺傳治療藥物提供了重要的理論依據(jù)。
ChIP-seq在本研究中的作用
參考文獻(xiàn)：
Wagner RT,et al. SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation. Genome Biol. 2025 Feb 5;26(1):22. pii: 10.1186/s13059-025-03483-z. doi: 10.1186/s13059-025-03483-z.
lysine 36,tri-methylation）蛋白的表觀遺傳因子。H3K36me3在RNA剪接、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，SETD2突變與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）中，SETD2突變與不良預(yù)后相關(guān)。然而，SETD2功能喪失型突變的靶向治療一直是一個挑戰(zhàn)。
近日，美國梅奧診所分子藥理學(xué)和實驗治療學(xué)系Keith D. Robertson團(tuán)隊聯(lián)合美國南卡醫(yī)科大學(xué) (MUSC) Hollings癌癥中心Thai H. Ho，合作探索了SETD2功能喪失型突變在癌癥中的作用機(jī)制，并尋找靶向這種突變的新型表觀遺傳靶向治療方法。研究通過一系列的實驗，包括基因組范圍內(nèi)的合成致死（synthetic lethal, SL）篩選、基因編輯、表觀遺傳分析（ChIP-seq）和藥物驗證等，揭示了SETD2缺失細(xì)胞對NSD1（nuclear receptor-binding SET domain protein 1）介導(dǎo)的H3K36甲基化具有特有敏感性，并提出了基于表觀遺傳修飾的個性化治療策略。相關(guān)研究成果以《SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to ePIgenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation》為題發(fā)表于《Genome Biology》期刊。
標(biāo)題：SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation（SETD2功能喪失型突變使細(xì)胞對NSD1介導(dǎo)的H3K36甲基化的表觀遺傳靶向治療具有獨特敏感性）
期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq等
本研究首先采用了一種無偏倚的全基因組范圍的合成致死篩選方法，鑒定出另一個H3K36me 的writer因子NSD1是SETD2突變細(xì)胞中的合成致死（SL）修飾因子，并在小鼠和人類的同源透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和永生化腎上皮細(xì)胞系中驗證了這種合成致死相互作用。通過CRISPRi靶向方法耗盡NSD1，會促進(jìn)SETD2突變細(xì)胞丟失，同時伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。但只有抑制NSD1（非其他相關(guān)H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶）才會在這些模型中促進(jìn)合成致死性。分別對NSD1和NSD2的基因組H3K36me2靶向進(jìn)行作圖，揭示了這些表觀遺傳writer因子的特異性功能。此外研究還通過使用BT5（一種靶向NSD1的首創(chuàng)藥物抑制劑）重現(xiàn)這種合成致死表型進(jìn)行概念驗證，表明了靶向這種合成致死相互作用的治療可行性。
本研究將全基因組篩選方法與最新的遺傳和藥理學(xué)建模方法相結(jié)合，揭示了一種全新的表觀遺傳方法，用于靶向癌癥中具有挑戰(zhàn)性的SETD2功能喪失突變進(jìn)行個性化治療。
研究方法
合成致死篩選：研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)在SETD2野生型和突變型的HAP1細(xì)胞系中進(jìn)行基因組范圍的篩選，尋找與SETD2缺失具有合成致死關(guān)系的基因。
基因編輯和細(xì)胞模型構(gòu)建：通過CRISPR/Cas9技術(shù)，研究者在多種細(xì)胞系中構(gòu)建了SETD2野生型和突變型的同源細(xì)胞模型，包括ccRCC細(xì)胞系786-O和A498，以及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）。
表觀遺傳分析：研究者利用ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測序）技術(shù)分析了H3K36me2和H3K36me3在基因組上的分布情況，以了解SETD2缺失對組蛋白修飾的影響。
藥物驗證：研究者使用BT5（一種針對NSD1的小分子抑制劑）驗證了通過藥物抑制NSD1是否能夠模擬基因敲除NSD1的合成致死效應(yīng)。
結(jié)果圖形
（1）CRISPR/Cas9篩選揭示NSD1是SETD2突變?nèi)撕托∈蠹?xì)胞中的合成致死（SL）修飾因子
通過CRISPR/Cas9篩選，研究者發(fā)現(xiàn)NSD1是SETD2缺失細(xì)胞的合成致死修飾因子。在SETD2突變的細(xì)胞中，NSD1缺失會導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降，伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。
圖1：全基因組篩選鑒定NSD1為SETD2缺失細(xì)胞中的潛在SL修飾因子。
A. 對同源SETD2野生型/突變型HAP1細(xì)胞中整體H3K36甲基化狀態(tài)的Western blot分析。
B. CRISPR/Cas9合成致死篩選的示意圖。
C. 火山圖突出顯示NSD1為合成致死靶點。
D. 對篩選出的127個SL候選基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)在參與表觀遺傳重塑和DNA損傷/修復(fù)因子中富集。
E. 基因視圖示意圖，展示通過Cre-lox切除第6外顯子實現(xiàn)MEFs中Setd2的誘導(dǎo)性缺失。
F. PCR基因分型確認(rèn)在Setd2flox/flox親本和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細(xì)胞系中他莫昔芬（tamoxifen）誘導(dǎo)的Cre活性。
G. Setd2flox/flox和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細(xì)胞系經(jīng)4-OHT處理后結(jié)晶紫染色。
（2）通過基因組編輯驗證新型SETD2同源/缺失ccRCC模型
SETD2功能缺失突變在多種不同的癌癥類型中很常見，但在ccRCC中最常見，其中SETD2缺失促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。因此研究人員選擇ccRCC細(xì)胞系786O和A498作為模型，以進(jìn)一步探究NSD1在驅(qū)動SETD2突變體SL中的作用。
圖2：同源SETD2突變的失活/激活功能模型在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）中的應(yīng)用A. 基因組示意圖突出顯示A498細(xì)胞系中SETD2的內(nèi)源性突變以及用于通過同源重組（HR）修復(fù)2個核苷酸缺失的基因組編輯策略。
B. 在HR和Cre介導(dǎo)的選擇載體（selection cassette）切除后，對“修復(fù)”的A498（SET-HDR）細(xì)胞系進(jìn)行PCR基因分型。
C. 通過Sanger測序色譜圖確認(rèn)A498 SET-HDR細(xì)胞系中“TG”缺失的修復(fù)。
D. 在4×放大倍數(shù)下，對A498親本和SET-HDR細(xì)胞系進(jìn)行明場形態(tài)學(xué)評估。
E. 對源自A498和786-O ccRCC細(xì)胞系的SETD2功能正常/缺失細(xì)胞系進(jìn)行整體H3K36甲基化狀態(tài)的Western blot分析。
F. 通過ChIP-seq揭示的A498 SET-HDR和FLAG-SETD2拯救系中H3K36me3增加的火山圖。
G. A498親本、SET-HDR和FLAG-SETD2系中H3K36me3峰的標(biāo)簽密度圖。
H. 對應(yīng)于A498和786O ccRCC細(xì)胞系的野生型、SETD2突變和拯救細(xì)胞系中H3K36me3 peaks的基因水平視圖。
（3）轉(zhuǎn)錄組學(xué)/表觀基因組分析揭示H3K36me2在SETD2突變細(xì)胞中的潛在補(bǔ)償作用
表觀基因組（ChIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）揭示SETD2缺失導(dǎo)致H3K36me3整體性丟失，而H3K36me2在基因組上的分布發(fā)生了顯著變化，特別是在SETD2缺失的細(xì)胞中，H3K36me2增加可能作為一種補(bǔ)償機(jī)制來維持基因組的穩(wěn)定性。
圖3：SETD2/H3K36me3丟失導(dǎo)致的表觀遺傳重組增加了H3K36me2標(biāo)記的普遍性
A-C. MA圖展示A498、786O和RPTEC同源模型中SETD2突變的差異基因表達(dá)。
D. A498、786O、RPTEC同源模型中SETD2突變及一組TCGA-KIRC的SETD2野生型/突變樣本的差異基因表達(dá)GSEA通路熱圖。
E. ccRCC模型中與干擾素信號和PD-1信號相關(guān)的SETD2依賴性調(diào)控的重疊GSEA富集圖。
F.在FLAG-SETD2拯救后，786-O突變細(xì)胞與野生型細(xì)胞（x軸）中差異表達(dá)基因逆轉(zhuǎn)（y軸）相關(guān)性圖。紅點表示在A498同源模型中觀察到的共有差異表達(dá)。
G. SETD2突變同源模型H3K36me3丟失peaks(黑色)和H3K36me2增加peaks(金色)火山圖。
H. A498和786O同源ccRCC中基因水平的H3K36me3(黑色)和H3K36me2(金色)peaks視圖。
(4) ccRCC細(xì)胞系通過CRISPRi抑制NSD1（而非NSD2或NSD3）能夠重現(xiàn)SETD2突變的SL表型
圖4:使用dCas9-KRAB急性耗竭NSD家族成員證實了與NSD1缺失相關(guān)的SL表型A. 在表達(dá)dCas9-KRAB的SETD2野生型/突變型786-O細(xì)胞系中，通過qRT-PCR分析詳細(xì)說明各個NSD因子的特異性耗竭情況。
B. 在786-O野生型細(xì)胞中，通過CRISPRi耗竭各個NSD因子后，對整體H3K36甲基化狀態(tài)進(jìn)行Western blot分析。
C. 評估在CRISPRi耗竭靶因子后細(xì)胞的相對適應(yīng)性的細(xì)胞競爭/譜系追蹤實驗示意圖。
D. 在786-O野生型和突變型CRISPRi細(xì)胞系中，NSD1耗竭（左）、NSD2耗竭（中）和NSD3耗竭（右）細(xì)胞的相對貢獻(xiàn)。
E. 在CRISPRi耗竭NSD1、NSD2和NSD3后，786-O和A498同源細(xì)胞系的集落形成實驗。
F. 集落形成實驗的定量分析。
（5）DNA損傷和凋亡是SETD2突變型SL表型的基礎(chǔ)
為了闡明SL表型背后的細(xì)胞效應(yīng)，研究人員在ccRCC同基因模型中進(jìn)行RNA-seq以定義SL的基因特征。
圖5：轉(zhuǎn)錄組分析揭示了與DNA損傷和凋亡相關(guān)的SL基因特征
A. 揭示A498和786-O同源模型中SL基因特征的轉(zhuǎn)錄組方法示意圖。
B. A498親本和SET-HDR細(xì)胞系的RNA-seq的主成分分析（PCA）圖，這些細(xì)胞系經(jīng)過sgCTRL、sgNSD1和sgNSD2轉(zhuǎn)導(dǎo)和選擇。
C. A498親本/sgNSD1樣本與A498親本/sgCTRL + A498 SET-HDR/sgNSD1（SETD2/NSD1雙敲除與剩余）之間的差異基因表達(dá)MA圖以揭示與模型相關(guān)的SL基因。
D. A498和786-O SL基因集的GSEA通路熱圖。
E. A498和786-O SL樣本中與凋亡和細(xì)胞防御相關(guān)信號的增強(qiáng)GSEA富集圖。
F. A498和786-O SL基因集中共同上調(diào)和下調(diào)的基因維恩圖。
G. 特異性耗竭NSD1、NSD2和NSD3的A498和786-O同源系中，相對caspase 3/7活性。
H. 在CRISPRi耗竭NSD1后，786-O突變細(xì)胞中caspase 3/7活性的升高FACs圖。
I. 在CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，786-O野生型和突變細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂標(biāo)記物γ-H2AX以及caspase 3/7活性FACs染色分析。
（6）差異性H3K36me2靶向突出NSD1和NSD2的不同活性
研究發(fā)現(xiàn)，盡管NSD1和NSD2都能催化H3K36me2，但它們在基因組上的作用位點和功能存在顯著差異。NSD1主要靶向增強(qiáng)子區(qū)域，而NSD2主要靶向基因體區(qū)域。
圖6：NSD1和NSD2的分子活性差異揭示其在指導(dǎo)SETD2突變SL中的不同活性A. 786-O野生型細(xì)胞通過CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后H3K36me2標(biāo)記的差異性ChIP-seq結(jié)果火山圖。NSD1特異性peaks（紫色）；NSD2特異性peaks（金色）；共有peaks（黑色）。
B. 在786-O野生型細(xì)胞中，對NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks進(jìn)行ChromHMM建模，對比H3K36me3、H3K36me2、H3K27ac、H3K27me2、H3K27me3和H3K4me1。
C. DeepTools分析NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks及其對H3K36me3相互調(diào)控。
D. NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2與H3K4me1和H3K36me3的重疊情況標(biāo)簽密度圖。
E. A498親本細(xì)胞中sgNSD1與sgNSD2的差異基因表達(dá)MA圖。
F. A498親本細(xì)胞CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，與SL基因CD82和IL6對應(yīng)的基因位點上H3K36me2 peaks（金色）的基因水平視圖。陰影區(qū)域表示NSD1特異性H3K36me2丟失。
（7）SETD2突變的ccRCC細(xì)胞系對NSD1的藥理抑制敏感
使用BT5抑制NSD1能夠模擬NSD1基因敲除效應(yīng)，SETD2突變細(xì)胞對BT5表現(xiàn)出更高的敏感性，這為開發(fā)靶向SETD2突變癌癥的表觀遺傳治療提供了有力的證據(jù)。
圖7：使用BT5抑制NSD1重現(xiàn)SETD2突變SL的遺傳模型
A. 為評估在特定抑制劑處理下，共培養(yǎng)中SETD2野生型/突變型細(xì)胞的相對適應(yīng)性，使用活細(xì)胞顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞競爭/譜系追蹤實驗。
B. 在SETD2功能正常細(xì)胞的共培養(yǎng)中，經(jīng)不同濃度BT5處理后，SETD2突變型786-O（左）和A498（右）的相對貢獻(xiàn)。
C. 786-O和A498同源細(xì)胞系在不同濃度BT5處理下的藥代動力學(xué)分析。
D. 經(jīng)不同濃度BT5處理3天后，整體H3K36甲基化水平的Western blot分析。
E. 經(jīng)5μM BT5（藥理學(xué)）處理或通過CRISPRi耗竭NSD1（遺傳學(xué)）處理的786-O SETD2突變細(xì)胞中差異表達(dá)基因的重疊情況維恩圖。
F. 比較BT5藥理學(xué)抑制和CRISPRi抑制之間共有差異表達(dá)基因相關(guān)性圖。
G. 在SETD2突變和H3K36me3（藍(lán)色）丟失下，NSD1介導(dǎo)的H3K36me2（黃色）在維持基因組保真度中的補(bǔ)償作用模型圖。
易小結(jié)
本研究揭示了SETD2缺失細(xì)胞對NSD1介導(dǎo)的H3K36甲基化的特有敏感性，并提出了通過靶向NSD1來治療SETD2突變癌癥的新策略。研究結(jié)果不僅增進(jìn)了對SETD2在癌癥中作用機(jī)制的理解，還為開發(fā)新型表觀遺傳治療藥物提供了重要的理論依據(jù)。
ChIP-seq在本研究中的作用
- 分析組蛋白修飾的變化：通過ChIP-seq，研究者精確地分析H3K36me2和H3K36me3在基因組上的分布變化，從而揭示SETD2缺失對組蛋白修飾的整體性影響。
- 揭示NSD1和NSD2的功能差異：ChIP-seq結(jié)果顯示NSD1和NSD2在基因組上的靶向位點不同，這一發(fā)現(xiàn)對于理解它們在SETD2缺失細(xì)胞中的不同作用機(jī)制至關(guān)重要。
- 驗證藥物作用機(jī)制：通過比較BT5處理前后的H3K36me2分布，研究者驗證BT5是否通過抑制NSD1的活性來影響組蛋白修飾，從而進(jìn)一步確認(rèn)藥物的作用機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：
Wagner RT,et al. SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation. Genome Biol. 2025 Feb 5;26(1):22. pii: 10.1186/s13059-025-03483-z. doi: 10.1186/s13059-025-03483-z.
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