文獻(xiàn)信息
農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)學(xué)院淡水動(dòng)物養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、湖北洪山實(shí)驗(yàn)室、教育部長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省魚類養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心、廣東嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室的研究成果“Generation of blunt snout bream without intermuscular bones by runx2b gene mutation”（基于runx2b基因敲除的無(wú)肌間刺團(tuán)頭魴新種質(zhì)創(chuàng)制）在海洋與淡水生物學(xué)領(lǐng)域的頂級(jí)期刊《Aquaculture》雜志上發(fā)表。平生公司的離活一體CT（NEMO）在論文中提供團(tuán)頭魴樣品的魚骨圖像和定量分析。該研究的通訊作者為高澤霞教授、萬(wàn)世明教授。第一作者為董強(qiáng)、聶春紅。

文獻(xiàn)摘要
團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）是我國(guó)重要的食草性淡水經(jīng)濟(jì)魚類。其經(jīng)濟(jì)價(jià)值受到肌間刺（IBs）存在的影響。作者之前的研究證明，runx2b是肌間刺形成的關(guān)鍵基因，通過(guò)敲除runx2b基因可以獲得穩(wěn)定的無(wú)肌間刺斑馬魚突變體。作者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，F(xiàn)0代runx2b突變體團(tuán)頭魴肌間刺的數(shù)量顯著減少。為了進(jìn)一步獲得無(wú)肌間刺的團(tuán)頭魴，作者通過(guò)F0代runx2b突變體團(tuán)頭魴進(jìn)行自交，獲得F1代團(tuán)頭魴突變體。隨后，對(duì)35尾F1代runx2b無(wú)肌間刺突變體進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)突變類型為：3種（靶點(diǎn)1）、13種（靶點(diǎn)2）、7種（靶點(diǎn)3）的，runx2b靶點(diǎn)1、2和3的突變效率分別為25.71%、94.28%和71.43%。茜素紅骨染色和X射線掃描分析表明，F(xiàn)1代runx2b無(wú)肌間刺突變體中沒有肌間刺，顯微CT分析發(fā)現(xiàn)，與野生型魚類相比，F(xiàn)1代runx2b無(wú)肌間刺突變體中其他骨骼的礦化沒有受到顯著影響（P>0.05）。RT-qPCR結(jié)果還表明，與野生型魚類相比，F(xiàn)1代runx2b無(wú)肌間刺突變體中骨相關(guān)基因的表達(dá)水平較低。隨后，作者使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法在120dpf下檢測(cè)野生型團(tuán)頭魴（有肌間刺）和F1代runx2b無(wú)肌間刺突變體（無(wú)肌間刺）肌肉組織的營(yíng)養(yǎng)成分。結(jié)果表明，野生型團(tuán)頭魴和F1代runx2b無(wú)肌間刺突變體在幼魚期的基本肌肉營(yíng)養(yǎng)成分（水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分）以及大多數(shù)氨基酸和脂肪酸的含量沒有顯著差異（P>0.05）。本研究證明，runx2b基因?qū)λa(chǎn)養(yǎng)殖魚類中肌間刺的形成起著至關(guān)重要的作用，并為獲得一種新的無(wú)肌間刺團(tuán)頭魴品系奠定了重要基礎(chǔ)，為無(wú)肌間刺性狀在經(jīng)濟(jì)型魚類中的應(yīng)用提供了一個(gè)很好的例子。

實(shí)驗(yàn)方法
使用MS-222對(duì)四個(gè)月大的野生型和F1代團(tuán)頭魴突變體進(jìn)行安樂(lè)死，并將其固定在4% PFA溶液中24小時(shí)。團(tuán)頭魴的掃描是在平生醫(yī)療科技（昆山）有限公司（PINGSENG Healthcare Inc.）的Nemo Micro-CT（NMC-200）設(shè)備上完成。該設(shè)備采用錐形束CT(cone beam CT)技術(shù)，是一種能夠達(dá)到高分辨率的成像技術(shù)。使用微計(jì)算機(jī)斷層掃描（μCT）（NEMO^?micro-CT，平生醫(yī)療，中國(guó)）以50μm的體素大小（使用90 kV的X射線管電位，65μA的X射線強(qiáng)度）掃描七個(gè)魚類樣本（4 runx2b+/+，3 runx2b?/?）。掃描過(guò)程中探測(cè)器和球管圍繞樣品艙中軸做360°旋轉(zhuǎn)，并在掃描區(qū)域內(nèi)進(jìn)行10000次投射，整個(gè)掃描時(shí)間為3500s。在探測(cè)器捕獲圖像后，將其傳輸?shù)接?jì)算機(jī)中，然后在Avatar軟件（版本1.7.2，PINGSENG Healthcare Inc.）上采用FDK法逆向重建出圖像，像素大小為50um×50um×50um。斑馬魚的組織密度測(cè)量是在用小鼠脛骨的標(biāo)準(zhǔn)骨密度體模（QRM Mirco CT HA，Moehrendorf，Germany）校準(zhǔn)后進(jìn)行的。使用閾值技術(shù)手動(dòng)追蹤脂肪（-200 < CT值 ≤ -80）和肌肉（-80 < CT值 ≤ 280）區(qū)域。通過(guò)使用FDK算法的3D重建軟件獲得脂肪和肌肉體積的量化。在用小鼠脛骨的標(biāo)準(zhǔn)骨密度模型（QRM-MircoCT-HA，德國(guó)Moehrendorf）校準(zhǔn)后，對(duì)團(tuán)頭魴進(jìn)行組織礦物質(zhì)密度測(cè)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
為了揭示肌間刺發(fā)育早期runx2b基因功能喪失后的肌間刺表型，通過(guò)茜素紅骨染色觀察了runx2b突變體F1代的肌間刺表型，并在45dpf的60尾runx2b突變體F1代團(tuán)頭魴中發(fā)現(xiàn)了27尾（45%）沒有肌間刺（圖4A）。當(dāng)runx2b突變體F1代生長(zhǎng)到四月齡時(shí)，使用X射線篩選runx2b突變體F1代團(tuán)頭魴個(gè)體共5000尾，最終發(fā)現(xiàn)316尾（6.32%）完全沒有肌間刺的團(tuán)頭魴個(gè)體（圖4B）。同樣，Micro-CT結(jié)果顯示，runx2b突變體F1代團(tuán)頭魴個(gè)體沒有肌間刺，而野生型有肌間刺（圖4C）。如圖4D所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在120dpf時(shí)，野生型（有肌間刺）和runx2b突變體（無(wú)肌間刺）的其他骨元素的組織礦物質(zhì)密度（TMD）值沒有顯著差異（P>0.05）。

圖4 野生型和runx2b突變個(gè)體的肌間刺表型。A、茜素紅骨染色45dpf；B、X-ray掃描；C、 Micro CT掃描。D、組織礦物質(zhì)密度（TMD）值四種不同的骨元素。

使用結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)獲得的無(wú)肌間刺團(tuán)頭魴F1代將為后續(xù)培育能穩(wěn)定遺傳的無(wú)肌間刺團(tuán)頭魴新品種奠定重要基礎(chǔ)，同時(shí)，本研究也是首次以團(tuán)頭魴為實(shí)驗(yàn)對(duì)象展開的無(wú)刺經(jīng)濟(jì)型魚類新品種的研究，為無(wú)肌間刺性狀在經(jīng)濟(jì)型魚類中的應(yīng)用提供一個(gè)很好的例子，但runx2b調(diào)控魚類肌間刺發(fā)生發(fā)育的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。此外，因runx2b基因缺失而獲得的無(wú)肌間刺團(tuán)頭魴的骨骼發(fā)育、生長(zhǎng)、游動(dòng)性能和肌肉營(yíng)養(yǎng)成分還需要進(jìn)行更全面系統(tǒng)的評(píng)估。

使用設(shè)備

 Micro CT (型號(hào)：NEMO) (平生醫(yī)療科技)
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）