DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，其在基因表達(dá)調(diào)控、基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用。UHRF1（ubiquitin-like, contAIning PHD and RING finger domains, 1）是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，可作為表觀遺傳修飾因子發(fā)揮作用，能夠招募DNMT1以維持DNA甲基化。在DNA復(fù)制過程中，UHRF1通過識(shí)別半甲基化的DNA和結(jié)合組蛋白H3來定位到新合成的DNA上，并通過其E3泛素連接酶活性泛素化組蛋白H3，從而促進(jìn)DNMT1的招募和DNA甲基化的維持。然而，UHRF1乙酰化修飾及其對(duì)DNA甲基化維持的具體作用機(jī)制尚不清楚。
 
近日，廣東省人民醫(yī)院心血管研究所/廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所/香港大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院王霖晟博士等為第一作者，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所/香港大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院/香港大學(xué)深圳醫(yī)院骨科中心周中軍教授、廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究所金國祥研究員為共同通訊作者，在《Cell Reports》期刊發(fā)表題為《MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance》的研究論文。研究揭示了MOF（males absent on the first）對(duì)UHRF1蛋白的乙酰化修飾如何調(diào)節(jié)DNA甲基化維持過程。研究發(fā)現(xiàn)，MOF能夠乙酰化UHRF1的K670位點(diǎn)，而HDAC1（histone deacetylase 1）則能夠去乙酰化該位點(diǎn)。這種乙酰化修飾增強(qiáng)了UHRF1的E3泛素連接酶活性，進(jìn)而促進(jìn)了組蛋白H3泛素化，這對(duì)于DNMT1（DNA methyltransferase 1）的招募和DNA甲基化維持至關(guān)重要。
 
標(biāo)題：MOF-mediated acetylation of UHRF1 enhances UHRF1 E3 ligase activity to facilitate DNA methylation maintenance（MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化增強(qiáng)了UHRF1 E3連接酶活性以促進(jìn)DNA甲基化維持）
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 7.5/Q1
技術(shù)平臺(tái)：RRBS等（易基因金牌技術(shù)）

本研究結(jié)果表明，MOF能夠乙酰化UHRF1的K670位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于pre-RING連接區(qū)，而HDAC1則能夠去乙酰化UHRF1的同一位點(diǎn)。此外，當(dāng)K670發(fā)生突變時(shí)，MOF還可以乙酰化K667和K668位點(diǎn)。MOF/HDAC1介導(dǎo)的UHRF1乙酰化受細(xì)胞周期調(diào)控，并在G1/S期達(dá)到峰值，這與UHRF1招募DNMT1以維持DNA甲基化的功能相一致。此外，UHRF1乙酰化顯著增強(qiáng)了其E3泛素連接酶活性。在這些位點(diǎn)上消除UHRF1乙酰化會(huì)減弱UHRF1介導(dǎo)的H3泛素化，進(jìn)而影響DNMT1的招募和DNA甲基化。綜合來看，這些發(fā)現(xiàn)確定了MOF是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶，并明確了通過MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化調(diào)節(jié)DNA甲基化維持的機(jī)制。
 
研究亮點(diǎn)

• MOF在K670位點(diǎn)乙酰化UHRF1，這一過程可被HDAC1消除。
• MOF介導(dǎo)的乙酰化增強(qiáng)了UHRF1的E3泛素連接酶活性。
• 消除UHRF1乙酰化會(huì)抑制組蛋白H3泛素化及DNMT1招募。
• UHRF1的K670位點(diǎn)乙酰化為DNA甲基化維持的正常功能所必需。

 
研究摘要  
研究方法
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，包括共轉(zhuǎn)染不同組的質(zhì)粒、免疫共沉淀、免疫熒光染色等，以研究UHRF1乙酰化修飾及其對(duì)DNA甲基化的影響。
體外實(shí)驗(yàn)：通過體外乙酰化實(shí)驗(yàn)，使用純化的GST-UHRF1和GST-MOF蛋白，驗(yàn)證了MOF對(duì)UHRF1的直接乙酰化作用。
質(zhì)譜分析：利用質(zhì)譜技術(shù)分析了MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化位點(diǎn)，確定K670為主要乙酰化位點(diǎn)，同時(shí)K667和K668也可以被乙酰化。
基因敲除和敲低實(shí)驗(yàn)：通過siRNA敲低MOF或在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲除UHRF1，研究其對(duì)DNA甲基化的影響。
DNA甲基化分析：采用免疫熒光染色、簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）等方法，分析DNA甲基化水平和模式的變化。
 
結(jié)果圖形
（1）MOF和HDAC1分別是UHRF1的乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶
  圖1：UHRF1特異性地被MOF乙酰化，并被HDAC1去乙酰化。
  （A）在HEK293T細(xì)胞中共表達(dá)FLAG-Myc-UHRF1和不同的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）。使用FLAG抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，并通過乙酰化賴氨酸抗體進(jìn)行免疫印跡分析以檢測(cè)乙酰化的UHRF1。EV代表對(duì)照組。
（B）將空載體或Myc-MOF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，對(duì)內(nèi)源性UHRF1進(jìn)行免疫沉淀，并使用UHRF1和泛乙酰化賴氨酸抗體進(jìn)行Western Blot分析。在免疫沉淀（IP）中使用免疫球蛋白G（IgG）作為UHRF1抗體的對(duì)照。
（C）通過將純化的GST-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進(jìn)行體外乙酰化實(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在沒有乙酰輔酶A的情況下進(jìn)行。使用乙酰化賴氨酸抗體檢測(cè)UHRF1的乙酰化情況，并通過GST抗體檢測(cè)UHRF1和MOF蛋白。
（D）將對(duì)照組和MOF小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到表達(dá)外源FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，并使用針對(duì)FLAG和乙酰化賴氨酸的抗體進(jìn)行Western Blot分析。
（E）在共轉(zhuǎn)染FLAG-Myc-UHRF1和空載體或Myc-HDAC1的HEK293T細(xì)胞中，使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后使用針對(duì)泛乙酰化賴氨酸、UHRF1和HDAC1的抗體進(jìn)行Western Blot分析。
 
（2）MOF在pre-RING連接區(qū)的K670位點(diǎn)周圍乙酰化UHRF1。
通過質(zhì)譜分析和突變實(shí)驗(yàn)，確定了MOF主要乙酰化UHRF1的K670位點(diǎn)，而K667和K668在K670突變時(shí)也可以被乙酰化。
  圖2：MOF在pre-RING連接區(qū)乙酰化UHRF1
  （A）上圖展示了用于乙酰化分析的野生型UHRF1和缺失不同結(jié)構(gòu)域的UHRF1突變體示意圖。將不同的Myc標(biāo)記的UHRF1構(gòu)建體單獨(dú)或與FLAG-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用Myc抗體進(jìn)行免疫沉淀（IP）后，通過Western Blot分析檢測(cè)input樣本和沉淀樣本中的Myc、FLAG或乙酰化賴氨酸。
（B）上圖展示了用于乙酰化分析的UHRF1和缺失連接區(qū)的構(gòu)建體示意圖。通過定點(diǎn)突變技術(shù)生成缺失連接區(qū)的UHRF1突變體構(gòu)建體。將UHRF1構(gòu)建體單獨(dú)或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測(cè)input樣本和沉淀樣本中的Myc和泛乙酰化賴氨酸。
  圖3：通過定點(diǎn)突變鑒定MOF介導(dǎo)的UHRF1乙酰化位點(diǎn)
  （A）通過質(zhì)譜分析鑒定出的UHRF1中得分最高的10個(gè)乙酰化賴氨酸位點(diǎn)示意圖。
（B）在有無MOF存在的情況下，野生型UHRF1片段（601-793氨基酸）及各種突變型UHRF1片段（601-793氨基酸）的乙酰化情況。外源性野生型UHRF1片段和不同突變型UHRF1片段經(jīng)FLAG抗體免疫沉淀后，使用泛乙酰化賴氨酸抗體進(jìn)行Western Blot分析。input樣本用Myc抗體分析外源性UHRF1片段和MOF的表達(dá)情況。
（C）在FLAG-Myc-UHRF1質(zhì)粒中，靶向K667/K668/K670賴氨酸簇進(jìn)行了賴氨酸到精氨酸的突變。將野生型或UHRF1點(diǎn)突變構(gòu)建體（均帶有FLAG-Myc標(biāo)簽）單獨(dú)或與Myc-MOF共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。使用FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀后，通過Western Blot分析檢測(cè)Myc和乙酰化賴氨酸。
（D）通過將純化的GST-UHRF1或突變型K667R/K668R/K670R（3KR）-UHRF1和GST-MOF與乙酰輔酶A（acetyl-CoA）共同孵育進(jìn)行體外乙酰化實(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在沒有乙酰輔酶A的情況下進(jìn)行。使用乙酰化賴氨酸抗體檢測(cè)UHRF1的乙酰化情況，并通過GST抗體檢測(cè)UHRF1和MOF蛋白。
 
（3）MOF在G1期和S期乙酰化UHRF1，并促進(jìn)DNA甲基化。
UHRF1乙酰化水平在細(xì)胞周期的G1/S期達(dá)到峰值，與UHRF1招募DNMT1的功能相一致。在UHRF1的K670、K667和K668位點(diǎn)突變的細(xì)胞中，DNA甲基化水平顯著降低，表明這些位點(diǎn)的乙酰化對(duì)DNA甲基化維持至關(guān)重要。
  圖4：UHRF1的細(xì)胞周期依賴性乙酰化及其乙酰化突變體對(duì)DNA甲基化維持的影響
  （A）在穩(wěn)定表達(dá)FLAG-Myc-UHRF1的HEK293T細(xì)胞中，UHRF1乙酰化水平在細(xì)胞周期中的代表性水平。在細(xì)胞周期釋放后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解物，并使用FLAG抗體對(duì)FLAG標(biāo)記的UHRF1進(jìn)行免疫沉淀。使用乙酰化賴氨酸和pS652-UHRF1抗體分析免疫沉淀樣本中UHRF1的總乙酰化和pS652磷酸化水平。使用FLAG抗體檢測(cè)沉淀物中UHRF1的加載量。pS652-UHRF1水平用作細(xì)胞周期標(biāo)記，因?yàn)樗贕2/M期達(dá)到峰值。
（B）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型FLAG-Myc-UHRF1并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MOF siRNA的HEK293T細(xì)胞通過雙重胸苷阻斷同步化，隨后進(jìn)行細(xì)胞周期釋放，并進(jìn)行與（A）相同的分析。
（C）在野生型和Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，以及通過FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1（FL）或3KR或ΔRING突變體UHRF1構(gòu)建體遺傳互補(bǔ)的Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，使用特異性5mC抗體進(jìn)行代表性免疫熒光分析。
（D）在Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中穩(wěn)定表達(dá)的FLAG-Myc標(biāo)記的人類野生型UHRF1和3KR突變體UHRF1通過西方印跡分析，使用UHRF1抗體進(jìn)行分析。β-肌動(dòng)蛋白用作加載對(duì)照。選擇兩個(gè)突變克隆和一個(gè)野生型克隆，其UHRF1表達(dá)水平與野生型ESCs中內(nèi)源性UHRF1水平相似，用于后續(xù)研究。
（E）通過RRBS測(cè)序檢測(cè)的野生型和Uhrf1 Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及通過FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1（hUHRF1）或3KR（克隆#2）UHRF1構(gòu)建體遺傳互補(bǔ)的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，基因區(qū)域各個(gè)部分的全局CG甲基化水平。
（F）在對(duì)照ESCs、Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs以及穩(wěn)定表達(dá)人類野生型或3KR突變體UHRF1的Uhrf1 Uhrf1-/-ESCs中，通過亞硫酸鹽測(cè)序分析IAP和LINE1位點(diǎn)的DNA甲基化狀態(tài)。
 
（4）MOF/HDAC1介導(dǎo)的UHRF1乙酰化對(duì)于通過H3泛素化在DNA甲基化維持過程中高效招募DNMT1至關(guān)重要
乙酰化突變的UHRF1不能有效地招募DNMT1到異染色質(zhì)區(qū)域，導(dǎo)致DNA甲基化缺陷。且乙酰化突變的UHRF1顯著降低了其對(duì)組蛋白H3的E3泛素連接酶活性，進(jìn)而影響DNMT1招募。
  圖5：UHRF1乙酰化為組蛋白H3泛素化和DNMT1招募所必需
  （A）在野生型Uhrf1胚胎干細(xì)胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及表達(dá)FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1或3KR突變體UHRF1或ΔRING突變體UHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，對(duì)Dnmt1進(jìn)行免疫熒光分析。
（B）來自至少三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表性Western Blot分析，用于檢測(cè)野生型小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）、Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）以及表達(dá)外源性人類FLAG-Myc標(biāo)記的野生型UHRF1或3KR（兩個(gè)克隆）突變體UHRF1的Uhrf1-/-小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的泛素化組蛋白H3。
（C）在HEK293T細(xì)胞中組蛋白H3.1泛素化。在存在MOF、HDAC1、MOF siRNA或HDAC1 siRNA的情況下，從HEK293T細(xì)胞中免疫沉淀的外源性FLAG-H3.1的泛素化通過Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。將裂解液進(jìn)行FLAG抗體的免疫沉淀（IP），以沉淀外源性組蛋白H3.1，隨后使用FLAG和血凝素（HA）抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以檢測(cè)H3.1和HA標(biāo)記的泛素。在FLAG IP樣本中顯示的HA標(biāo)記的泛素反映了FLAG-H3.1的泛素化水平。
（D）在HEK293T細(xì)胞中PML4的泛素化。將HA-PML4、Myc-UHRF1和FLAG-泛素構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，在有無MOF或HDAC1存在的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在收獲前6小時(shí)用5μM MG132處理細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液進(jìn)行HA抗體的免疫沉淀，以沉淀外源性表達(dá)的野生型HA-PML4，隨后使用HA、FLAG抗體進(jìn)行免疫印跡分析，以檢測(cè)PML4和FLAG標(biāo)記的泛素。
 
（5）在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲低Mof會(huì)降低DNA甲基化水平。
  圖6：在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中敲低Mof會(huì)降低DNA甲基化
  （A）通過穩(wěn)定表達(dá)兩種不同的KAT8短發(fā)夾RNA（shRNA），生成了兩條Mof（KAT8）敲低（KD）小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）系。對(duì)野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）的細(xì)胞裂解液分別用MOF和UHRF1抗體進(jìn)行免疫印跡分析。
（B）對(duì)野生型、Uhrf1-/-和Mof敲低小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中的5mC水平進(jìn)行免疫熒光染色。對(duì)內(nèi)源性H4K16ac進(jìn)行染色以反映Mof乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。
（C）通過RRBS測(cè)序檢測(cè)的野生型和Mof敲低（clone 1）小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）基因組DNA在不同基因組區(qū)域的整體CpG DNA甲基化譜。
（D）在野生型、Uhrf1-/-和穩(wěn)定敲低Mof的野生型小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中，通過亞硫酸鹽測(cè)序分析IAP和LINE1位點(diǎn)的DNA甲基化情況。
 
易小結(jié)
本研究揭示了MOF對(duì)UHRF1的乙酰化修飾是DNA甲基化維持的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。UHRF1的K670、K667和K668位點(diǎn)的乙酰化增強(qiáng)了其E3泛素連接酶活性，促進(jìn)了組蛋白H3泛素化，從而有助于DNMT1招募和DNA甲基化維持。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解DNA甲基化維持的分子機(jī)制提供了新視角，還可能為相關(guān)疾病的治療提供潛在靶點(diǎn)。

RRBS在本研究中的作用
RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一種用于分析基因組中DNA甲基化模式的技術(shù)。在本研究中，RRBS被用于分析不同基因型小鼠胚胎干細(xì)胞（包括野生型、UHRF1敲除型和表達(dá)突變UHRF1的細(xì)胞）的全基因組DNA甲基化水平。

1. 單堿基分辨率檢測(cè)不同基因組區(qū)域的DNA甲基化水平，揭示UHRF1乙酰化突變對(duì)DNA甲基化維持的整體影響。
2. 鑒定在不同細(xì)胞類型或處理?xiàng)l件下發(fā)生顯著甲基化變化的基因組區(qū)域（差異甲基化區(qū)域），為理解UHRF1在DNA甲基化維持中的作用提供了基因組學(xué)證據(jù)。
3. 結(jié)合基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分析DNA甲基化變化對(duì)基因表達(dá)的潛在影響，進(jìn)一步揭示UHRF1乙酰化在表觀遺傳調(diào)控中的功能。

參考文獻(xiàn)：
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