生物負荷測試
生物負荷：制藥與醫材安全的關鍵角色
 
生物負荷 (Bioburden)，也稱為生菌數或負荷菌，通常指的是產品、原材料或表面上存在的活體微生物總數量 (如細菌、真菌、病毒等)。它能有效評估和控制產品的微生物含量，不僅是確保產品質量的基石，更是保障患者與消費者安全的關鍵。
 
為什么生物負荷測試很重要?
 
生物負荷測試 (Bioburden testing)，又稱為生菌數測試 (total viable count, TVC) 或微生物限量(度)測試 (microbial limit testing)，是制藥與醫療產業中關鍵的質量控制過程 (quality control, QC)，用于偵測及量化產品在滅菌前的活體微生物含量，能夠反映原料質量、生產流程潔凈度、污染控制狀況，并作為制定滅菌參數及驗證滅菌效果的依據。

全球主要法規機構，如美國食品藥品監督管理局 (FDA) 和國際標準化組織 (ISO)，都明確要求需執行生物負荷測試。例如：
 
· ISO 11737-1：被廣泛用作醫療器材的生物負荷測試標準，并被歐盟醫療器材法規 (EU MDR) 和 美國食品藥物管理局 (FDA 510 (k)) 認可為共識標準。
· 美國藥典USP <61>, <62>, <1115>：涵蓋非無菌產品 (nonsterile products) 微生物限度與控制策略。
生物負荷測試被廣泛應用于醫療器材、制藥、生物制劑和食品與保健品等高風險產業，做為確保產品安全與法規合規的關鍵步驟

生物負荷測試一般在最終滅菌程序 (terminal sterilization) 前、或在無菌制程 (aseptic processing) 中「無菌過濾或充填步驟」前進行。測試結果所反映的微生物含量，即為整體制程潔凈度的指標。因此，生物負荷測試被視為制程潔凈驗證與污染控制策略中的關鍵步驟，其代表意義如下：
 
· 滅菌策略設定：
微生物的數量及類型會直接影響最終滅菌的有效性。如果生物負荷過高，即使按照標準流程進行滅菌，也可能無法完全殺死所有微生物。因此，生物負荷水平越低，產品越容易滅菌。
· 質量管理及控制：
透過定期監測生物負荷水平能確認制程潔凈度是否穩定、指出制程中的破口，并且使最終產品的微生物含量符合規范范圍內。
· 風險評估：
生物負荷有助于評估產品對患者或消費者的潛在感染風險。特別是醫療器材，若無法有效控制生物負荷，可能導致醫療相關感染 (Healthcare-associated infections, HAIs)。其特性分析有助于了解內毒素 (endotoxin) 的存在，即使滅菌成功，部份細菌仍會釋出內毒素，對患者健康造成潛在風險。
· 法規要求：
許多國家和地區的法規，例如 ISO 11737-1，都要求醫療器材和藥品制造商定期進行生物負荷測試，以符合相關的質量和安全標準。
 
生物負荷的來源是什么? 如何控制負荷菌 (bioburden control) ?
 
微生物 (microbial) 可透過多種管道進入產品或原料中。從原物料、人員、設備，乃至整個制造過程，都必須透過嚴格監控，使滅菌程序發揮最大功效，制成使用安全無虞的產品。
常見的生物負荷來源及控制方式如下表所示：
 

來源	控制方式
原材料	對原材料進行微生物檢測和控制
制造環境	維持潔凈的生產環境，例如：使用無塵室、空氣過濾系統等
人員	穿著無菌服裝，并遵守嚴格的衛生程序
設備與工具	定期對設備和工作表面進行徹底清潔和消毒
制造過程	遵守無菌操作規范，并選擇產品合適的滅菌方法

 
常見的生物負荷試驗流程及方法？

1. 收集樣品與處理：
依檢品之物理特性選用適用的前處理方式，取得待測檢液。若無適用方法，則應建立適當之替代序程。
 

樣品	檢液配制
水溶性檢品	以適當緩沖液或培養基溶解
非油性不溶于水檢品	以適當緩沖液或培養基溶解，可添加界面活性劑
油性檢品	檢品溶解于適當酯類溶劑，再以預熱稀釋液稀釋檢品
噴霧式液體/固體檢品	將容器中檢品移入微孔濾膜過濾裝置
貼片檢品	具有黏性之面朝上放在無菌容器中，覆蓋無菌多孔材料，再將貼布移入適當稀釋液中，振蕩至少30分鐘

 
2. 選擇適合的測試方法：
為了量化負荷菌，目前主流有四種定量分析方法，包含微孔濾膜過濾法 (Membrane Filtration Method)、傾注培養法 (又稱混合稀釋法，Pour Plate Method)、表面涂布法 (又稱涂抹法，Spread Plate Method) 以及多重試管法 (又稱最確數法，Most-Probable-Number, MPN)，請根據檢液特性選用適合的測試方法：
 

/	微孔濾膜過濾法(Membrane Filtration Method)	培養皿法 / 平板法 (Plate Count Methods)		多重試管法 (Most-Probable-Number, MPN)
		傾注平板法 (Pour Plate Method)	表面涂布法 (Spread Plate Method)
原理	檢液以 0.45 μm 濾膜過濾后，將濾紙置于培養基上，進行培養	將檢液與未凝固之培養基一起倒入培養皿中，進行培養	將檢液涂抹于培養基中，進行培養	將檢液進行至少3個連續10倍之序列稀釋，進行培養
適合樣品	可過濾之大量液態、生物負荷較低的樣品	無法過濾之樣品，如凝膠、黏膠物質等	無法過濾之少量樣品	生物負荷極低的產品
適用熱敏感物質	是	否	是	是
準確度	高	高	高	低
培養時間	約 5~7 天	約 3~7 天	約 3~7 天	約 3~7 天
結果單位	菌落形成單位 (CFU)	菌落形成單位 (CFU)	菌落形成單位 (CFU)	依最確數表推估

* 一般認為多重試管法 (MPN) 是最不準確的方法，因此本法僅于無其他方法適用時才予選用。
 
3. 結果判定：
根據試驗結果判定產品是否符合法規標準，或用以評估最終滅菌所需之水平。
 
其中， 微孔濾膜過濾法不僅是最常見的生物負荷檢測方法之一，也可以移除檢體中的干擾物質。若待測樣品中含有抑制微生物的生長與繁殖的成分，如抗菌劑 (antimicrobial agent) 或其他具抑菌活性 (antibacterial activity) 的成分，可能會導致檢測結果出現偽陰性 (即樣品中實際存在微生物，但因生長受抑制而未被檢出)。因此，當檢體特性適合以微孔濾膜過濾法操作時，該方法常被視為進行生物負荷試驗的首選技術。其方法是將檢液通過 0.45 μm 的濾膜，捕捉大于孔徑的微生物，再將濾膜轉置至適當培養基中培養，觀察菌落生長情形。
 
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「生物負荷試驗 」與「 無菌試驗 」的差異? 
 
生物負荷試驗 (bioburden testing) 與 無菌試驗 (sterility testing) 是醫療器材和制藥行業中，確保產品無菌性的兩個不同但相關的測試，其目的、執行時機和方法有所不同。
 

/	生物負荷試驗 (bioburden testing)	無菌試驗 (sterility testing)
目的	量化并監控制程中的活體微生物總量	確定最終產品的無菌性
執行時機	產品最終滅菌前的制程中設立檢查點	產品經最終滅菌后
操作環境	一般層流柜 (laminar flow)	無菌檢測隔離器 (Isolator)
		潔凈度 Class 100 (A級)
測試方法	微孔濾膜過濾法 傾注平板法 表面涂布法 多重試管法	微孔濾膜過濾法 直接接種法
測試對象	未經滅菌前的產品 非要求無菌之產品	最終產品 要求無菌之產品
樣器類型	藥品 (固體及液體)	藥品 (固體及液體) 醫療器材
測試結果	CFU 數值 (微生物含量)	是/否無菌
結果應用	評估滅菌劑量和參數；微生物監測和趨勢分析、制程風險評估	驗證產品無菌性，最終放行產品的依據之一
標準依據	ISO 11737-1 USP <61> USP <62>	ISO 11737-2 USP <71>
中華藥典	(7007.1) 微生物計數法 (7007.2) 特定微生物檢驗法	(7001) 無菌試驗法

 
總體而言，生物負荷試驗是預防性和制程控制的工具，用以了解和管理產品在滅菌前的微生物含量信息；而無菌試驗則是驗證性和質量保證的工具，目的為確認最終產品在經過滅菌處理后是否符合無菌要求
 
應用
§ 醫療器材產業：如手術刀片、導管、縫線、人工關節等
§ 制藥產業：無菌注射劑、藥品原料、生物制劑 (疫苗、抗體、細胞治療產品) 等
§ 食品產業：食品廠環境監控、水樣監測等
§ 化妝品：產品原料