腺相關(guān)病毒（AAV）

是基因治療中強(qiáng)大的遞送載體。然而，在AAV組裝時(shí)，其包裝核酸序列的效率很低，導(dǎo)致只有一小部分病毒顆粒攜帶目標(biāo)基因。富集純化這些正確組裝的病毒顆粒是下游純化工作流程中的關(guān)鍵步驟。15-60% w/v的碘克沙醇（IDX）不連續(xù)密度梯度離心是一種成熟的從細(xì)胞裂解物中純化AAV衣殼的主要方法。在實(shí)驗(yàn)過程中，鋪設(shè)碘克沙醇不連續(xù)密度梯度是一項(xiàng)費(fèi)力的工作，并且可能因操作人員的技能水平而導(dǎo)致結(jié)果的不穩(wěn)定性。

為了應(yīng)對(duì)這一操作難題，我們開發(fā)了這套OptiMATE全自動(dòng)密度梯度分液系統(tǒng)的自動(dòng)化解決方案。該系統(tǒng)消除了梯度液制備中的手動(dòng)步驟，包括準(zhǔn)備儲(chǔ)備試劑、分液和離心管密封。OptiMATE可運(yùn)行已建立的成熟方案，具有更高的一致性、準(zhǔn)確性和易用性。

我們列出了OptiMATE自動(dòng)化制備標(biāo)準(zhǔn)的IDX不連續(xù)梯度液的完整體系。同時(shí)，手動(dòng)鋪設(shè)了相同梯度層的梯度液，并從以下幾方面進(jìn)行對(duì)比：

• 離心管可變性；
• 梯度液折射率；
• 鋪設(shè)梯度液操作時(shí)間；
• vgs回收率。

方法

表1：用于進(jìn)行IDX對(duì)照研究的離心管溶液組分

血清型2  AAV通過三重轉(zhuǎn)染在HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)后。裂解細(xì)胞并離心以去除碎片。然后，使用類似于梯度分析實(shí)驗(yàn)的15-60%（w/v）IDX不連續(xù)密度梯度液（表1，圖1）純化含有AAV的裂解澄清物。在自動(dòng)組中，使用OptiMATE將IDX不連續(xù)密度梯度液分配到39 mL聚丙烯快封管中。每個(gè)離心管中加入2.08×10¹²病毒基因組（vgs）的AAV。在手動(dòng)組中，使用OptiMATE^TM IDX制備IDX儲(chǔ)備溶液（15%、25%、40%和60%），然后使用注射器和鈍頭針頭通過底層法將每層梯度液分配到離心管中。自動(dòng)組制備的離心管在儀器上自動(dòng)進(jìn)行密封，而手動(dòng)組制備的離心管用無(wú)線熱封器手動(dòng)封口。在Optima XPN-90超速離心機(jī)中，使用Type 70 Ti轉(zhuǎn)子中于16 °C下以63,000 rpm（407,427 xg）將離心管離心2小時(shí)。離心后，通過側(cè)面穿刺提取AAV條帶（在40%-60% IDX界面處），并使用離心旋轉(zhuǎn)過濾器進(jìn)行緩沖液替換。通過qPCR（AAVPro滴定試劑盒，Takara Bio）對(duì)vgs進(jìn)行定量以評(píng)估回收率。

圖1：全自動(dòng)（上）與手動(dòng)（下）配置15-60% w/v IDX不連續(xù)密度梯度液的AAV純化方案對(duì)比

結(jié)果

我們通過離心管的總重量和使用折射儀測(cè)量梯度液的折射率來(lái)進(jìn)行對(duì)比評(píng)估。測(cè)量的離心管總重量結(jié)果表明，自動(dòng)化分液和密封后,離心管之間的可變性較低（表2）。盡管手動(dòng)分配的離心管的可變性也較低，但如果操作人員技能不足，可變性可能會(huì)加劇。

圖2顯示了離心管中梯度液的密度與累積體積的關(guān)系。與手動(dòng)的IDX不連續(xù)梯度液相比，OptiMATE分配的IDX不連續(xù)梯度液具有較高的準(zhǔn)確性、更清晰的界面，并且保持在移液誤差允許的范圍內(nèi)。兩種方法中都存在一些層間擴(kuò)散，這可歸因于界面混合和分液過程引起的擴(kuò)散。

表2：手動(dòng)分液和OptiMATE自動(dòng)分液的離心管重量對(duì)比。誤差值為標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

圖2：比較OptiMATE（紅色）和手動(dòng)流程（藍(lán)色）配置的梯度液的密度曲線分布情況。基于預(yù)期移液誤差的不同IDX層的預(yù)期密度理論曲線也被展示出來(lái)（淺灰色框）。綠色框標(biāo)記AAV衣殼在曲線上的預(yù)期位置（在40-60% w/v界面處）。誤差范圍為標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）

圖3比較了手動(dòng)和使用OptiMATE制備離心管的時(shí)間。不考慮數(shù)學(xué)計(jì)算或方法創(chuàng)建所花費(fèi)的情況下，使用OptiMATE制備兩個(gè)39mL快封管的速度明顯比手動(dòng)快。雖然OptiMATE的總時(shí)間為31分鐘，手動(dòng)為19分鐘（多39%），但人工操作時(shí)間從手動(dòng)的31分鐘減少到OptiMATE的僅需5分鐘（減少84%），這突顯了人員時(shí)間和精力的大幅減少。隨著離心管數(shù)量的增加，手動(dòng)鋪設(shè)和自動(dòng)鋪設(shè)之間的時(shí)間差異將進(jìn)一步擴(kuò)大，這也再一次凸顯了OptiMATE系統(tǒng)并行分配和密封離心管的優(yōu)勢(shì)。

圖3：使用OptiMATE或手動(dòng)鋪設(shè)兩根39毫升快封管的IDX不連續(xù)密度梯度液示意圖。制備步驟為淺灰色，分液和密封步驟為深灰色

為了評(píng)估AAV純化效率，從離心管中回收含有AAV2樣品的條帶，使用qPCR分析條帶中填充衣殼的含量（表3）。兩種純化方法回收的AAV量相差不大，并且與IDX不連續(xù)梯度液純化的預(yù)期值匹配。由于該純化的主要目標(biāo)是在初步純化步驟中將AAV2衣殼與細(xì)胞雜質(zhì)分離，而不是區(qū)分空衣殼和完整衣殼，因此我們僅專注于比較vgs的回收率。

表3：純化回收后的AAV2的qPCR分析結(jié)果

結(jié)論

OptiMATE可精確分配不連續(xù)梯度液，解決了密度梯度超速離心中的兩個(gè)主要挑戰(zhàn)：勞動(dòng)強(qiáng)度和一致性。

• 梯度液的一致密度分布和純化后AAV2 vgs的回收率共同證明了這一點(diǎn)。
• 操作界面簡(jiǎn)潔方便搭配自動(dòng)化和精確性的使用流程，即使是新用戶也能快速輕松的進(jìn)行樣品純化。
• 設(shè)置和操作更加快速簡(jiǎn)化了整個(gè)工作流程，同時(shí)降低了操作人員接觸化學(xué)和生物材料的風(fēng)險(xiǎn)。
• 此外，該儀器可無(wú)縫集成到現(xiàn)有的純化過程中，降低了鋪設(shè)高質(zhì)量不連續(xù)密度梯度液的門檻，并提高了整體流程的效率。