免疫檢查點阻斷療法（ICB）是癌癥治療領域的革命性突破，然而目前僅有少數癌癥患者能從現有ICB治療中獲益。除T細胞功能障礙外，超過65%的腫瘤存在MHC-I缺失現象，這成為ICB治療原發性和獲得性抵抗的共同機制。MHC-I缺失的細胞應被自然殺傷（NK）細胞清除，但許多腫瘤仍能逃逸NK細胞的殺傷。這一矛盾現象背后的機制尚不明確。


2024年5月，上海尋百匯生物科技有限公司團隊在《Cell》（IF：42.5）發表了題為IGSF8 is an innate immune checkpoint and cancer immunotherapy target的研究文章。該研究利用CRISPR技術，篩選出IGSF8為NK細胞檢查點，它通過與NK細胞表面KIR3DL2受體的特異性相互作用來抑制NK細胞功能。單獨使用抗體阻斷IGSF8或聯合抗PD1治療可以顯著抑制腫瘤生長，證明IGSF8是一個天然免疫檢查點及癌癥免疫治療靶點。

研究亮點

●  IGSF8在抗原呈遞缺陷的惡性細胞中高表達

●  IGSF8通過與NK受體相互作用抑制NK細胞毒性

●  抗IGSF8抗體在體外增強NK細胞對惡性細胞的殺傷作用

●  抗IGSF8單藥或聯合抗PD1治療在體內抑制腫瘤生長
 

Section.01

共培養CRISPR篩選鑒定IGSF8為NK細胞檢查

作者提出假說：MHC-I缺陷的惡性細胞通過表達特定蛋白來抑制NK細胞功能，從而逃避免疫清除。為系統鑒定具有NK細胞檢查點功能的蛋白分子，研究人員分別在MHC-I表達正常的COLO205人結腸癌細胞系和MHC-I缺陷的AGS人胃癌細胞系中建立了NK細胞共培養CRISPR篩選體系。通過慢病毒感染兩種細胞（COLO205是全基因組敲除文庫，而AGS細胞是細胞表面蛋白編碼基因敲除文庫），單獨或者與人原代NK細胞共培養過夜（圖1A）。

▲圖1 Identification of IGSF8 as a suppressor of NK cell killing

通過高通量測序分析編輯后的COLO205和AGS細胞在NK細胞處理前后的sgRNA豐度變化，并采用MAGeCK算法鑒定兩組間差異選擇的基因。研究人員對負向選擇基因（即敲除后使惡性細胞對NK細胞殺傷更敏感的基因）進行了研究，并確實發現了許多已知能抑制NK細胞殺傷作用的基因。例如，在COLO205細胞中，MHC-I分子（包括與KIR2D家族受體結合的HLA-C、與NKG2A結合的HLA-E）是最顯著的負向選擇基因（圖1B）；兩株細胞共有的其他負向選擇基因，如EPCAM、CD38、PVR。兩株細胞中正向選擇基因共同包含了已知的NK細胞活化配體：COLO205中顯著富集的是NCR3LG1（又稱B7-H6）；AGS中則是ICAM1、MICA/B和CD58（圖1C）。這一結果支持了所用方法的可靠性，并驗證了NK細胞共培養CRISPR篩選實驗的有效性。同時，研究人員也發現了IGSF8在兩項篩選中均持續表現為強負向選擇基因（圖1B）。研究人員在COLO205和AGS細胞系中敲除IGSF8，與NK細胞共培養，發現NK細胞的殺傷效率顯著提升（圖1D、1E）。IGSF8是一個進化上保守的基因，人與小鼠之間的序列一致性達90%。研究人員敲除B16-F10中的Igsf8，觀察到NK細胞殺傷顯著增強（圖1F和1G），這表明IGSF8對NK細胞的抑制在人與小鼠之間是保守的。Igsf8敲除對B16-F10細胞的體外生長影響很小，但它顯著降低了C57BL/6同源小鼠體內腫瘤的生長（圖1H）。對腫瘤浸潤CD45+細胞的流式分析顯示，B16-F10中Igsf8敲除導致NK細胞和CD8 T細胞顯著增加，而對巨噬細胞影響很?。▓D1I）。比較移植17天后有或無Igsf8敲除的B16-F10腫瘤的RNA-seq圖譜發現，腫瘤中Igsf8敲除導致NK細胞介導的細胞毒性顯著上調，抗原加工呈遞和T細胞信號傳導增加（圖1J）。以上結果表明IGSF8是一種NK細胞檢查點和新的免疫治療靶點。

Section.02

IGSF8通過與特定NK受體相互作用來抑制NK細胞功能

IGSF8蛋白通常與外周血單個核細胞（PBMC）中的靜息NK細胞相互作用較弱，但在CRISPR篩選中使用的擴增NK細胞，這種相互作用顯著增強（圖2A和2B）。研究人員分選了與IGSF8蛋白結合能力處于最低10%和最高90%的擴增NK細胞，通過比較這兩個細胞群體的RNA-seq圖譜，發現KIR3DL2是差異表達最顯著的細胞表面受體（圖2C）。在表達六種不同KIR家族成員的Fc融合蛋白實驗中，僅KIR3DL2能與過表達IGSF8的小鼠CT26細胞結合（圖2D）。擴增后的NK細胞中KIR3DL2表達顯著增加（圖2E），這與IGSF8蛋白對這些細胞結合增強的現象一致（圖2B）。在九名不同供體的擴增NK細胞實驗中，研究人員觀察到KIR3DL2表達水平與IGSF8結合強度呈顯著正相關（圖2F）。這些結果共同證實了IGSF8與人NK細胞表面KIR3DL2受體之間存在特異性相互作用。

將擴增的原代NK細胞與過表達IGSF8、HLA-C或HA標簽對照的K562細胞共孵育，檢測NK細胞脫顆粒水平。結果顯示，K562-HLA-C能普遍抑制NK細胞的脫顆粒（無論KIR3DL2表達水平如何），而K562-IGSF8僅特異性抑制KIR3DL2+ NK細胞的脫顆粒（圖2G）。使用類似的方法，研究人員發現Ly49家族中的Klra9 mRNA在結合Igsf8蛋白的NK細胞中顯著富集（圖2H），只有Klra9蛋白能特異性結合CT26-Igsf8細胞（圖2I）。

▲圖2 Identification of KIR3DL2 and Klra9 as the binding partner of IGSF8 on NK cells

Section.03

IGSF8在多種癌癥中的表達情況以及與不良預后的關系

通過對96項研究的腫瘤單細胞RNA-seq數據分析，研究人員進一步證實IGSF8在惡性細胞中表達水平最高（圖3B）。相比之下，KIR3DL2在TCGA癌癥樣本中總體表達量較低且拷貝數變異稀少，但特異性地表達于NK細胞和T細胞（圖3B）。在TCGA數據庫分析的腫瘤中，IGSF8 mRNA表達與CD8、顆粒酶、穿孔素、CD274（PDL1）以及MHC-I成員B2M呈負相關（圖3C）。與癌旁正常上皮細胞相比，惡性細胞（特別是MMRp腫瘤）表現出B2M表達顯著降低和IGSF8表達升高（圖3D）。更重要的是，我們在同一腫瘤樣本的不同惡性細胞中觀察到MHC-I與IGSF8蛋白呈現異質性且互斥的表達模式（圖3E）。在TCGA數據庫的宮頸癌、子宮內膜癌、結腸癌、非小細胞肺癌和黑色素瘤中，MHC-I低表達腫瘤群體內，高IGSF8表達與更差的生存率顯著相關（圖3F）。另一項抗PD-1治療前后黑色素瘤樣本的研究表明，治療有效組的腫瘤組織IGSF8水平顯著降低（圖3G）。以上結果說明，IGSF8在多種癌癥中呈現高表達并與不良臨床預后相關。

▲圖3 Evaluation of IGSF8 and KIR3DL2 gene expression profiles in patient tumors

Section.04

阻斷IGSF8與NK細胞受體相互作用的抗體可增強NK細胞殺傷功能

研究人員開發了一種靶向IGSF8的抗體（IGSF8.06）用于阻斷IGSF8與其結合配體的相互作用。該抗體與人類IGSF8具有高親和力（圖4A）。該抗體可特異性阻斷KIR3DL2與過表達人源IGSF8的CT26細胞結合（圖4B），以及Klra9與過表達小鼠Igsf8的CT26細胞結合（圖4C）。Fc沉默型IGSF8.06抗體還能提升PBMC來源NK細胞對過表達IGSF8的K562細胞的殺傷效率（圖4D）。隨后，研究人員檢測了武漢尚恩生物的原代肺癌、結腸癌和肝癌惡性細胞（這些細胞均具有可檢測的IGSF8和MHC-I表達），發現IGSF8.06處理同樣能增強PBMC來源NK細胞對這些惡性細胞的殺傷（圖4E-4G）。為探究IGSF8.06抗體激活NK細胞的作用是否依賴KIR3DL2，研究人員在COLO205或K562-IGSF8惡性細胞與NK92/NK92-KIR3DL2細胞的共培養體系中測試了該抗體。結果顯示：IGSF8.06抗體能顯著增強NK92-KIR3DL2細胞對COLO205和K562-IGSF8細胞的殺傷，但對野生型NK92細胞的殺傷能力無影響（圖4H）。此外，該抗體顯著提高了表達Klra9的小鼠脾臟來源擴增NK細胞對黑色素瘤B16-F10細胞的細胞毒性（圖4I）。這些結果共同證明，IGSF8.06抗體通過阻斷IGSF8與其NK細胞受體的相互作用來增強NK細胞對惡性細胞的殺傷能力。

▲圖4 Development of an anti-IGSF8 antibody to activate NK cell-mediated cytotoxicity

Section.05

抗IGSF8抗體在體內展現出顯著的抗腫瘤效果

研究人員在B16-F10同源腫瘤模型中評估了Fc沉默型IGSF8.06抗體的體內療效，發現使用抗體后腫瘤增長受到顯著抑制 (圖5A)。對腫瘤浸潤CD45+細胞的流式分析顯示，IGSF8.06治療顯著增加了NK細胞、T細胞和樹突狀細胞（DC）的浸潤，但對巨噬細胞影響甚微（圖5B）。進一步研究發現，雖然使用抗CD4或CD8b抗體清除CD4/CD8 T細胞僅適度影響IGSF8.06抗體的體內療效（圖5C），但用抗NK1.1抗體清除NK細胞則完全消除了其治療效果（圖5D）。由于該抗體在小鼠體內不具備Fc介導的效應功能,這些結果表明IGSF8.06抗體通過阻斷作用激活NK細胞是其產生體內抗腫瘤活性的關鍵機制。我們進一步評估了IGSF8.06抗體作為單藥或聯合抗PD1治療在黑色素瘤（B16-F10）、Lewis肺癌（LLC）、結腸癌（CT26）和三陰性乳腺癌（EMT6）同源腫瘤模型中的體內療效。在所有模型中，IGSF8.06單藥治療均展現出顯著的體內抗腫瘤活性（圖5E），并且顯著提升小鼠的生存率（圖5F）。

▲圖5 Igsf8 blockade by IGSF8.06 promotes anti-tumor immunity in vivo

總 結

在這項研究中，研究人員通過CRISPR篩選，發現腫瘤表達的IGSF8通過與人NK細胞上的KIR3DL2受體相互作用來抑制NK細胞功能。阻斷IGSF8與NK細胞受體相互作用的抗體可增強NK細胞殺傷功能。在小鼠腫瘤模型中，IGSF8.06單藥或與抗PD-1聯合治療均展現出顯著的體內抗腫瘤活性。研究結果表明，IGSF8是一種先天免疫檢查點和潛在的腫瘤治療靶點。

尚恩產品引用

【SNPM-H045】人肺癌細胞完全培養基

【SNPM-H136】人結腸癌細胞完全培養基

【SNPM-H066】人肝癌細胞完全培養基