DNase I 作為一種功能多樣且極為重要的酶，發揮著不可替代的作用。它能夠非特異性地對 DNA 進行切割，最終生成 5' 端帶有磷酸基團的二核苷酸、三核苷酸，或者寡核苷酸片段。憑借這一特性，DNase I 成為了強大的 DNA 操作研究工具，廣泛應用于諸多分子生物學實驗流程之中

一、DNase I 單位的精準界定
DNase I 的比活性是衡量其降解雙鏈 DNA 能力的關鍵指標。在過去，其比活性多采用庫尼茨單位（Kunitz）來表示。一個庫尼茨單位的定義為：以鮭魚精子 DNA 作為底物，在 0.1M NaOAc（pH 5.0）緩沖液的特定條件下，能夠使反應液每分鐘的吸光度增加 0.001 所需要的酶量。但值得注意的是，這種用于定義庫尼茨單位的緩沖液條件，與實際實驗中 DNase I 消化 DNA 時所使用的典型緩沖液條件存在差異。如今，新的活性測定程序借助實時熒光分析法，能夠實現對 DNase I 活性更為快速且定量的測量，為 DNase I 活性評估提供了更精準的方式，進而給出了在標準條件下更能反映其降解 DNA 能力的單位定義。

二、影響 DNase I 活性的關鍵因素
1.金屬離子的作用
DNase I 在僅含有 Mg2 + 卻不含 Ca2 + 的緩沖液環境中，實際上并不具備活性。有研究文獻表明，在看似不含 Ca2 + 的緩沖液中若檢測到 DNase I 存在少量活性，極有可能是由于鈣離子污染所引發的協同激活作用。Ca2 + 能夠與 DNase I 緊密結合，進而穩定其活性結構。即便是處于微摩爾水平的 Ca2+，在 Mg2 + 同時存在的情況下，也能夠有效地激活 DNase I 的活性反應。若在緩沖液中加入遠低于 Mg2 + 濃度，但高于 Ca2 + 濃度的 EGTA，能夠有效抑制 DNase I 活性，抑制程度可達 1000 倍甚至更高。

2.緩沖液離子強度的影響
緩沖液的離子強度同樣是影響 DNase I 活性的重要因素之一。當緩沖液中僅含有 Mg2 + 與 Ca2+，且不存在其他鹽類時，DNase I 能夠展現出最高的活性。一旦標準反應緩沖液中加入的鹽（如 NaCl 或 KCl）濃度從 0 逐漸增加至 30mM，DNase I 的活性將會降低超過 2 倍。雖然在某些轉錄緩沖液中也含有一定量的鹽，但由于其中所含的 DNase I 量遠遠超過降解 DNA 模板所需的量，因此依然能夠取得較好的 DNA 降解效果。

三、DNase I 剪切作用的特異性剖析
當 DNase I 對非勻質的雙鏈 DNA（dsDNA）進行消化時，其產物主要為 60% 的雙核苷酸、25% 的三核苷酸以及少量的寡核苷酸。DNase I 能夠作用的最小片段為三個核苷酸組成的片段。盡管通常認為 DNase I 切割 DNA 的過程不具有特異性，但深入研究發現，它實際上對某些序列片段存在偏好。

例如，相較于其他區域，DNase I 更容易作用于 DNA 的小溝區，并且在嘌呤 - 嘧啶序列處進行剪切的傾向更為明顯。不過，在面對非勻質 dsDNA 時，DNase I 會對四種堿基都進行剪切，且對任何一種特定堿基的作用程度相較于其他堿基，不會超出 3 倍以上。此外，DNase I 雖然能夠對單鏈 DNA（ssDNA）以及 RNA - DNA 雜交鏈中的 DNA 進行剪切，但其活性相較于切割 dsDNA 時大大降低。例如，其剪切 ssDNA 的比活性僅約為剪切 dsDNA 比活性的五百分之一，在 RNA - DNA 雜合鏈中的活性小于作用于 dsDNA 時活性的 1 - 2% 。但由于實驗中往往使用遠高于實際需求濃度的 DNase I，所以在特定檢測條件下，其對 ssDNA 和 RNA - DNA 雜合鏈的切割程度會有所不同。

四、在 RNA 制備中去除 DNA 污染的應用及要點
1.DNA 污染來源及處理需求
在 RNA 制備過程中，使用 DNase I 降解殘留的 DNA，從而將基因組 DNA 的含量控制在較低水平（低于 10μg/ml），對于避免其對后續的 RT - PCR 實驗產生干擾至關重要。一次 DNase I 反應能夠處理的 RNA 量，與樣品中 DNA 污染的程度密切相關。在進行有機萃取，或者采用固相 RNA 純化方法時，如果二氧化硅基體過載，均有可能引入 DNA 污染。另外，從某些特定組織（如脾、腎、胸腺）以及轉染后的細胞中提取的 RNA，通常也更容易存在較高水平的 DNA 污染。有研究報告指出，采用 Chomcynsk 和 Sacchi 方法從腫瘤組織中提取 RNA 時，所提取的 RNA 中可能含有 7% 的 DNA，若 RNA 制備的規模較大，DNA 的量甚至可以達到微克級別。

2.實現 DNA 完全去除的挑戰與策略
要實現將 RNA 樣品中的每一條 DNA 鏈都完全去除，幾乎是一項難以完成的任務。因為 RT - PCR 技術具有極高的敏感性，能夠從復雜的非勻質混合物中擴增單個分子。在進行 40 次以上的 PCR 反應循環后，即便在無逆轉錄的對照反應中，也幾乎每次都會產生擴增條帶，這充分表明了 DNA 污染的普遍存在。所以，在實驗過程中，選擇最為適宜的 DNase I 消化條件以及合理設定 RT - PCR 的循環次數顯得尤為重要。為了最大程度地實現 DNA 的完全降解，應當采用特定的緩沖液。同時，在進行消化處理時，需注意不能使 RNA 濃度過高，應先將 RNA 樣品稀釋至約 100 μg/ml 以內再進行操作。DNase I 的使用量也需根據 DNA 污染的程度進行合理調整。