牛傳染性鼻氣管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR）是由牛皰疹病毒 1 型（Bovine Herpesvirus 1, BoHV-1）引起的牛呼吸道傳染病，可導致發熱、鼻氣管炎、結膜炎、流產等癥狀，給養牛業造成嚴重經濟損失。gD 蛋白（糖蛋白 D） 是 BoHV-1 的主要包膜糖蛋白之一，具有高度免疫原性和功能重要性，是 IBR 防控研究中極具價值的靶標。利用真核表達系統生產的 gD 蛋白能更精準模擬天然蛋白的結構與功能，在疫苗研發和診斷應用中意義顯著，具體如下：

一、gD 蛋白的生物學特性與真核表達的必要性

1. 核心功能與結構特點

   • gD 蛋白（分子量約 60-65 kDa）是 BoHV-1 包膜上的關鍵糖蛋白，其核心功能包括： 
     • 病毒入侵：作為病毒與宿主細胞結合的主要介導分子，通過識別宿主細胞表面的受體（如 nectin-1、HVEM），啟動病毒包膜與細胞膜的融合，是病毒感染的關鍵步驟。
     • 免疫原性：能誘導宿主產生高效價的中和抗體，該抗體可直接阻斷病毒與受體的結合，從而抑制病毒入侵，是機體抵御 BoHV-1 感染的核心保護性免疫應答來源。
     • 免疫調節：可激活 T 細胞免疫應答（如 CD4?和 CD8? T 細胞增殖），增強細胞毒性作用，清除被感染的細胞。
   • 結構上，gD 含多個 N - 糖基化位點（約 4-6 個）和構象依賴型中和表位，其功能活性（如受體結合、中和抗體誘導）高度依賴正確的折疊及糖基化修飾。

2. 真核表達的不可替代性

   • 原核表達系統（如大腸桿菌）無法對 gD 進行糖基化修飾，且易導致蛋白錯誤折疊，使其無法形成天然構象的中和表位，誘導中和抗體的能力大幅下降。
   • 真核表達系統（如哺乳動物細胞、昆蟲細胞）可提供糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾環境，確保 gD 蛋白的三維結構與天然病毒粒子上的 gD 一致，從而保留其關鍵功能（如中和抗體誘導、受體結合）。

二、gD 真核表達系統的選擇與優化

根據 gD 蛋白的結構需求（糖基化、可溶性、中和表位完整性），常用真核表達系統及特點如下：

 

表達系統 適用場景 優勢與不足 哺乳動物細胞 需高活性中和表位的 gD 蛋白 優勢：糖基化模式與牛（天然宿主）一致，蛋白折疊最接近天然狀態，誘導中和抗體的效率最高；
不足：表達量較低（通常為 1-5 mg/L），成本高，適合疫苗候選物研發。 昆蟲細胞 - 桿狀病毒系統 中量制備高免疫活性 gD 蛋白 優勢：表達量較高（5-20 mg/L），可實現正確折疊和部分糖基化（核心糖基化），成本適中，適合診斷抗原或疫苗試驗；
不足：糖基化鏈較短（缺乏復雜糖型），可能影響部分表位活性。 酵母系統（如畢赤酵母） 低成本大規模制備診斷用抗原 優勢：易培養，表達量高（20-100 mg/L），可分泌表達（便于純化），適合批量生產診斷抗原；
不足：糖基化為高甘露糖型，可能掩蓋部分中和表位，誘導中和抗體的能力較弱。

 

優化策略：

• 密碼子優化：根據宿主細胞的密碼子偏好性改造 gD 基因（如增加牛或昆蟲細胞偏好的密碼子），提升翻譯效率。
• 截短表達：去除 gD 蛋白的跨膜區（保留胞外功能域），促進蛋白分泌到培養基中，減少胞內聚集和降解。
• 載體改造：使用強啟動子（如 CMV 啟動子、多角體蛋白啟動子）和信號肽（如牛 β- 乳球蛋白信號肽、gp64 信號肽），增強蛋白表達和分泌。

三、gD 真核表達蛋白的應用

1. 疫苗研發

   • 亞單位疫苗：真核表達的 gD 蛋白是 IBR 亞單位疫苗的核心成分。研究表明，哺乳動物細胞表達的 gD 免疫牛后，可誘導高水平中和抗體（效價可達 1:512 以上），能有效抵抗 BoHV-1 的攻擊，保護率達 70%-85%。其保護機制主要依賴中和抗體阻斷病毒入侵，同時可激活 Th1 型細胞免疫（如 IFN-γ 分泌），抑制病毒在細胞內復制。
   • 病毒樣顆粒（VLPs）疫苗：將 gD 與 BoHV-1 的其他結構蛋白（如 gB、gH）共表達，可組裝成不含病毒核酸的 VLPs，其結構與天然病毒粒子相似，能高效激活黏膜免疫和系統免疫。例如，昆蟲細胞表達的 gD-VLPs 免疫犢牛后，可誘導持久的黏膜抗體（IgA），減少病毒經呼吸道傳播的風險。
   • 活載體疫苗：將 gD 基因插入腺病毒、痘病毒等真核載體，通過載體在牛體內表達 gD 蛋白，持續刺激免疫系統。例如，重組腺病毒表達的 gD 可誘導牛產生長達 6 個月以上的中和抗體，適合規模化免疫。

2. 診斷試劑開發

   • 抗體檢測：以真核表達的 gD 為抗原建立 ELISA 方法，可特異性檢測牛血清中的抗 BoHV-1 中和抗體。相比原核表達抗原，真核 gD 因保留天然構象，能準確區分免疫抗體和感染抗體，且與其他皰疹病毒的交叉反應率低（<3%），適用于牛群免疫效果評估和流行病學調查。
   • 病毒檢測：利用 gD 特異性單克隆抗體（以真核 gD 為免疫原制備）建立膠體金試紙條或熒光定量 PCR 方法，可快速檢測牛分泌物（如鼻拭子、眼分泌物）中的 BoHV-1 抗原，實現早期診斷。

3. 病毒學研究

   • 受體結合機制：通過真核表達的 gD 蛋白，研究其與宿主細胞受體（如 nectin-1）的相互作用位點，明確 BoHV-1 入侵的分子機制，為開發抗病毒藥物（如受體阻斷劑）提供靶點。
   • 抗原變異分析：表達不同流行株的 gD 蛋白，通過交叉中和試驗分析其抗原差異，監測 BoHV-1 的變異趨勢，指導疫苗株的更新。

四、研究挑戰與解決方向

1. 免疫持續性不足：單一 gD 蛋白誘導的免疫保護期較短（通常 3-6 個月）。可通過與其他免疫原性蛋白（如 gB）聯合表達，或使用佐劑（如油乳佐劑、CpG 佐劑）延長免疫持續時間。
2. 表達量與成本限制：哺乳動物細胞表達的 gD 活性最佳，但產量低、成本高，限制了大規模應用。可通過改造宿主細胞（如 CHO 細胞）的代謝通路，或開發懸浮培養 - 高密度發酵系統，提升表達量并降低成本。
3. 糖基化修飾的影響：不同真核系統的糖基化差異可能影響 gD 的免疫原性。可通過基因工程改造宿主細胞的糖基轉移酶（如在昆蟲細胞中表達哺乳動物糖基轉移酶），實現更接近天然的糖基化修飾，提升 gD 蛋白的功能活性。

牛傳染性鼻氣管炎病毒 gD 真核表達蛋白因保留天然構象、糖基化修飾及中和活性，是 IBR 亞單位疫苗和診斷試劑的核心材料。隨著真核表達技術的優化（如高產系統、多抗原聯合設計），其在牛群 IBR 防控中的應用將更加高效，對減少畜牧業損失、保障牛群健康具有重要意義。