圖. 異位表達對譜系示蹤的影響^[1]

上一期，我們講述了雙重組酶介導的獨家報告基因類型，這種類型常用于標記 A⁺B^-（反之亦然）的細胞類型，這種標記存在先后順序，相反的先后順序會極大的影響后續的標記結果。而本次課程，我們來講述另一種常用的標記A⁺B^-的報告基因系統——嵌套報告基因系統。

譜系示蹤系類課程往期回顧：
【譜系示蹤系列第一期】基礎細胞標記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導的多色報告系統方法
【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導的交叉報告基因方法
譜系示蹤的難點——基因標記的異位表達如何避免？（上） 

嵌套報告基因系統

嵌套報告基因系統的結構是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。這類系統是利用兩個重組系統，將一對識別位點放置于另一對識別位點與報告基因的兩端，形成一個重組系統包裹著另一個重組系統的嵌套結構。如果內部的重組系統發生重組后，外部的重組系統仍然可以發生第二次重組；但外部重組系統發生重組時，內部的序列全部被切除，無法進行再次重組。

以下圖為例，嵌套報告基因小鼠的基因重組為：

1 A⁺B^- 細胞：
makerA 介導 Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列被切除）。該系統按照啟動子的方向，表達綠色熒光 ZsGreen。

2 A⁺B⁺ 細胞：
makerB 介導 Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、一對 Loxp 位點與全部的 stop 序列被切除），之后，該系統按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

3 A^-B⁺ 細胞：
makerB 介導 Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、一對 Loxp 位點與全部的 stop 序列被切除），之后，該系統按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

因此，A⁺B^-細胞被標記為綠色。A^-B⁺細胞、A⁺B⁺細胞被標記為紅色。

嵌套報告基因小鼠如何幫助我們避免基因標記的異位表達呢？若我們想標記 MarkerA 的細胞，啟動子 A 介導的 Cre-loxP 內部重組可能導致細胞 A 呈綠色。然而，如果啟動子 A 在“不需要的”細胞 B（A⁺B⁺細胞）中也被激活，由于 B 類型細胞中特定啟動子 B 驅動的外部 Dre-rox 重組已經去除 ZsGreen 基因，因此這部分“不需要的”細胞 B（A⁺B⁺細胞）仍呈現紅色。通過使用嵌套報告基因系統將異位表達的細胞標記為其他顏色，從而排除 MarkerA 異位表達的影響。

案例1

Sox9+ 膽道上皮細胞是否在肝臟再生過程中形成肝細胞仍然存在爭議。一些譜系追蹤研究報告說，Sox9-CreER 標記的膽道上皮細胞（BEC）可能有助于體內平衡和損傷后的肝細胞；其他研究報告說，新產生的肝細胞來源于損傷后預先存在的肝細胞。值得注意的是，Sox9 在 BEC 和一些門脈周圍肝細胞中表達，這導致使用傳統的 Sox9-CreER 標記不夠準確，新的肝細胞可能來自Sox9-CreER 標記的預先存在的肝細胞。
 

因此利用肝細胞特異性標記白蛋白 Alb-DreER與嵌套報告基因系統可區分Sox9+ BEC和Sox9+ 肝細胞。Sox9+ BEC被標記為綠色，Sox9+ Alb+肝細胞被標記為紅色，Alb+肝細胞也被標記為紅色。至此，精確標記的ZsGreen+ BEC和tdTomato+ 肝細胞可用于重新評估 Sox9+ BEC 在肝臟修復過程中對肝細胞的貢獻。針對肝損傷后的小鼠進行熒光檢測分析表明，BEC 不會再生新的肝細胞，而只是在CCl₄ 誘導的肝損傷后增殖以補充 BEC。
 

圖. 嵌套報告基因系統準確標記 BECs^[1]

因此，嵌套報告系統可用于破解一些定義具有已知陽性和陰性 marker 的干細胞的細胞命運。這種方式較獨家報告基因系統的優勢是 Dre-rox 和 Cre-loxP 的重組順序不會影響最終結果，并且，嵌套報告基因系統更適合使用雙誘導型重組系統（例如 CreER 和 DreER）進行細胞譜系示蹤。

那么，經過兩期的學習，處理基因異位表達的兩套報告基因系統大家了解了嗎？，我們來再次復習一下：

嵌套報告基因系統
Nested reporter systems

• 嵌套報告基因系統的結構是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。
• 嵌套報告系統可用于破解一些定義具有已知陽性和陰性marker的干細胞的細胞命運。
• Dre-rox 和 Cre-loxP 的重組順序不會影響最終結果
• 更適合使用雙誘導型重組系統

獨家報告基因系統
Exclusive reporter systems

• 獨家報告基因系統的結構是 Rosa26-CAG-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。
• 獨家報告系統可用于破解一些定義具有已知陽性和陰性marker的干細胞的細胞命運。
• 這種標記存在先后順序，相反的先后順序會極大的影響后續的標記結果。
• 建議兩個重組酶中一種采用可誘導類型的重組酶，從而合理控制重組發生的先后順序。

那在實際設計實驗時，我們應該如何選擇報告系統呢？
 

嵌套報告基因系統VS獨家報告基因系統

選擇哪種雙報告系統取決是否需要控制A&B的表達重組酶的時間，以及重組酶的類型選擇。

情況一
A&B不僅在目的組織中特異性表達，也在發育期/干細胞期廣泛表達。
在這種情況下，由于AB表達位置存在發育期表達的干擾，因而需控制A、B蛋白的表達時間，此時存在兩種情況：

a. 僅需控制單個marker的表達時間：
以marker A 需控制表達為例，由于marker A需調控表達時間，因而需使用A介導的可誘導的重組酶。此時，B介導的重組酶可以選擇可誘導的或者是組成型的（無需誘導）。如果選擇組成型的話，請確保A和B發生的重組順序正確，即可選擇獨家報告系統；如果選擇可誘導的，這時我們需選擇嵌套報告系統。

b. 需控制雙個marker的表達時間：
這種情況下，A與B都需要選擇可誘導的重組酶，這時我們需選擇嵌套報告系統。

情況二
A&B僅在目的組織中特異性表達，不會在發育期/干細胞期表達。
在這種情況下，無需調控A&B的表達時間，選擇哪種雙報告系統就取決于重組工具的類型，如果B介導的重組工具是組成型的，而A介導的重組工具是誘導型的，即可選擇獨家報告系統；如果A和B介導的重組都是可誘導的，即可選擇嵌套報告系統。

多重組酶介導的遺傳方法增強了細胞命運圖譜的特異性和精確性，從而可以在生物過程中發現前所未有的細胞事件。策略的選擇主要取決于基因表達、可用的小鼠工具和要解決的科學問題。在避免基因異位表達方面，我們不僅可以在報告小鼠方面做文章，我們還可以針對重組酶進行設計。

下一期鼠博士為大家講解可用于避免基因異位表達的loxCre與roxCre報告系統。這一報告系統的神奇之處在于一種重組酶的活性受到另一種重組酶的調控，這種制約關系可幫助我們更精準地標記目的細胞。請大家敬請期待~

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, CAI D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapPIng studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領域，打造了以基因修飾動物模型研發為核心，涵蓋多物種模型構建、飼養繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產品解決方案。