文獻解讀：PM2.5暴露通過m6A甲基化調控雄性生殖功能損傷機制_abio生物試劑品牌網
近日，陸軍軍醫大學軍事預防醫學系王建康博士和張中豪博士為并列第一作者、劉晉?t教授為唯一通訊作者，在《Environmental Pollution》期刊上發表了題為“WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure”的研究論文。研究主要從m6A修飾角度揭示了PM2.5暴露對雄性生殖功能損傷的作用及其潛在機制。作者通過建立實時PM2.5暴露的小鼠模型和GC-2spd細胞系，發現PM2.5暴露會導致精子發生上皮損傷、精子運動能力下降，并且通過改變睪丸組織中m6A修飾圖譜，尤其是影響Hmgb2基因的m6A修飾，進而影響精子發生相關基因的表達，最終導致精子活力降低。該研究不僅為理解PM2.5對男性生殖健康的危害提供新視角，還為未來開發靶向環境污染導致生殖損傷的干預措施提供了理論依據。
標題：WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure（WTAP介導的Hmgb2 m6A修飾促進PM2.5暴露誘導的精子發生損傷）
發表時間：2025年4月1日
發表期刊：Environmental Pollution
影響因子：IF7.3/Q1
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術）
作者單位：陸軍軍醫大學軍事預防醫學系王建康、張中豪、劉晉?t等
doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896
N6-甲基腺苷（m6A）廣泛參與復雜的精子發生過程，同時對環境暴露極為敏感。眾多研究表明，細顆粒物（PM2.5）對男性生殖系統具有毒性，但其中涉及的具體表觀遺傳機制尚未得到充分研究。本研究通過構建實時PM2.5暴露的小鼠模型和GC-2spd細胞系，研究了m6A修飾對PM2.5誘導的男性生殖功能障礙的影響。結果表明，PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮受損、精母細胞線粒體異常以及精子運動能力顯著下降。MeRIP-seq基因富集分析結果表明，與對照組相比，經PM2.5處理的小鼠睪丸組織中差異m6A修飾基因在精子發生過程中顯著富集，且甲基轉移酶WTAP表達在PM2.5暴露后顯著降低。此外，PM2.5暴露導致精子發生相關基因Hmgb2表達以及Hmgb2 m6A修飾水平顯著降低。轉錄組測序（RNA-seq）及驗證實驗表明，Hmgb2可能調控精母細胞中的ATP（腺苷三磷酸）水平。研究還證實m6A甲基轉移酶WTAP通過m6A修飾影響Hmgb2 mRNA穩定性。本研究為理解PM2.5對精子發生損害以及精子運動能力降低提供了新見解。
研究圖形摘要
研究方法
動物實驗：8周齡實驗小鼠隨機分為三組，分別暴露于高濃度環境顆粒物（CAP，483.6μg/m3）、正常環境未過濾空氣（UA，59.8μg/m3）和過濾空氣（FA，0.4μg/m3）中，每組8只小鼠。暴露結束后，對小鼠睪丸進行組織學檢查、精子運動能力檢測、超微結構觀察等。
細胞實驗：使用小鼠來源的精母細胞（GC-2spd體外細胞系）進行細胞實驗，將 PM2.5標準物質SRM1648a制備PM2.5股溶液（5mg/mL），選擇 0、25、50、100μg/mL 四個濃度的 PM2.5進行細胞實驗。
基因敲低與過表達：分別對Wtap和Hmgb2進行過表達和敲低操作。
轉錄組測序：對Hmgb2敲低的GC-2spd 細胞進行轉錄組測序（RNA-seq），分析RNA表達變化。
MeRIP-Seq：對睪丸組織的m6A RNA免疫沉淀測序，檢測不同組暴露小鼠的m6A甲基化水平變化。
特定位點m6A修飾檢測（MeRIP - qRT - PCR）：根據 MeRIP-Seq結果設計特異性引物進行 qRT - PCR 檢測特定位點 m6A修飾水平。
結果圖形
（1）PM2.5暴露導致精子細胞損傷和精子運動能力下降
研究者構建了實時PM2.5暴露的小鼠模型，通過組織學檢查發現PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮受損，表現為增加的空泡化和精子細胞排列紊亂（圖1A）。對VII期精子發生小管中的細胞計數顯示，PM2.5暴露后，粗線期精母細胞數量顯著減少，而精原細胞和圓形精子數量雖有下降趨勢，但差異未達到統計學意義，支持細胞數量未發生顯著變化（圖1B-E）。超微結構觀察顯示，PM2.5暴露后，精母細胞線粒體受損，表現為線粒體嵴減少和外膜破裂（圖1F），提示精母細胞是PM2.5暴露的關鍵靶細胞。此外，通過計算機輔助精子分析系統（CASA）分析小鼠精子運動能力，與過濾空氣（FA）組相比，正常環境（UA）組精子運動能力相關參數（總精子運動能力、超激活、PR和VSL）呈現下降趨勢，但差異未達到統計學意義，而高濃度環境顆粒物（CAP）組所有參數均顯著下降（圖1G-J）。這些結果表明PM2.5暴露對小鼠精子發生和運動能力產生了明顯負作用。
圖1：PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮損傷和精子運動能力下降。 A 睪丸組織HE染色切片的代表性圖像。
(B-E) VII期精子發生小管中的精子細胞計數，包括精原細胞（B）、粗線期精母細胞（C）、圓形精子（D）和Sertoli細胞（E）（n=8）。
(F) 睪丸超微結構的代表性圖像。紅色箭頭線：受損的線粒體（嵴減少和外膜破裂）。
(G-J) 通過CASA測量的精子運動能力相關參數，包括總精子運動能力（G）、前向運動能力（PR，H）、直線速度（VSL，I）和精子超活化（J）（n=8）。
（2）PM2.5暴露誘導睪丸m6A甲基化圖譜變化
為深入了解m6A修飾在PM2.5誘導的雄性生殖損傷中的作用，研究者對睪丸組織細胞中的RNA m6A進行高通量測序（MeRIP-seq）。在FA組中，m6A修飾基因主要在精子發生、精子與透明帶結合以及精子細胞發育等過程中富集，表明m6A修飾在正常雄性生殖過程中發揮功能（圖2A）。進一步分析差異甲基化區域（DMRs，P<0.05），結果表明與FA組相比，CAP組有152個顯著上調甲基化區域和105個顯著下調甲基化區域，而UA組與FA組之間有298個上調區域和85個下調區域（圖2B）。這些DMRs主要位于mRNA結構的CDS和3'UTR區域（圖2C）。對DMRs的motif分析顯示，CAP組和FA組的DMRs主要出現在HGACC等motif中，而UA組和FA組的DMRs主要出現在HCGAH等motif中（圖2D）。對CAP、UA和FA組中差異m6A修飾基因的功能富集分析顯示，精子發生過程顯著富集（圖2E和F）。這些結果表明m6A修飾可能參與PM2.5誘導的雄性生殖損傷過程。MeRIP-Seq技術在這一部分發揮關鍵作用，其對RNA上的m6A修飾進行高通量測序，從而全面揭示PM2.5暴露后睪丸組織中m6A修飾的整體變化情況，為后續尋找關鍵靶基因提供基礎。
圖2：CAP、UA和FA組睪丸轉錄組范圍內的差異m6A甲基化特征。
(A) FA組中m6A修飾基因的基因本體（GO）富集分析。
(B) 差異m6A修飾peaks分析。
(C) 差異甲基化區域（DMRs）在mRNA上的分布模式。
(D) DMRs的motif分析。（R=A/G，H=A/C/U）
(E-F) CAP組與FA組（E）以及UA組與FA組（F）中不同m6A修飾基因的生物過程富集分析。
（3）Hmgb2是一個關鍵的差異表達m6A修飾精子發生相關基因
研究者進一步分析了FA、UA和CAP組之間的差異m6A修飾精子發生相關基因的交集，共鑒定出10個潛在關鍵基因（Hmgb2、Tdrd5、Hspa1l、Bag6、Setx、Pax5、Map7、Dnm2、Chd5和PIwil1）。對這些基因在小鼠睪丸中的mRNA表達水平進行驗證分析，結果表明Hmgb2和Piwil1在PM2.5暴露小鼠睪丸中顯著下調，而Tdrd5顯著上調（圖3A）。在GC-2spd細胞中存在類似結果（圖3B）。HMGB2蛋白在PM2.5暴露小鼠睪丸中的表達顯著降低（圖3C和D），但在體外模型中，HMGB2蛋白水平在PM2.5處理后也顯著下調（圖3E和F）。MeRIP-Seq結果顯示，PM2.5暴露后睪丸組織中Hmgb2的m6A修飾減少（圖3G），這一結果在體外模型中也得到進一步驗證（圖3H）。基于這些數據，研究者將關注點聚焦于Hmgb2基因。MeRIP-Seq不僅能夠檢測到Hmgb2基因m6A修飾變化，還精確定位修飾發生的具體區域，為后續研究Hmgb2基因m6A修飾的功能提供重要依據。
圖3：PM2.5暴露后GC-2spd細胞和睪丸中Hmgb2表達下調。
(A-B) 小鼠睪丸（A）和GC-2spd細胞（B）中10個關鍵差異m6A修飾的精子發生相關基因mRNA表達（n=3）。
(C) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白的表達。
(D) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細胞中HMGB2蛋白的表達。
(F) 細胞中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(G) 小鼠睪丸中Hmgb2 mRNA甲基化峰的可視化。
(H)通過MeRIP-qRT-PCR檢測PM2.5暴露對GC-2spd細胞中Hmgb2 m6A修飾的作用（n=3）。
（4）Hmgb2下調介導小鼠精子發生細胞中的ATP水平變化
Hmgb2在精子發生和精子運動能力中的具體功能尚不清楚。研究者構建了Hmgb2敲低的GC-2spd細胞系并進行RNA-seq轉錄組測序，共鑒定出199個差異表達基因（DEGs），包括145個上調基因和54個下調基因（圖4C）。對這些DEGs進行通路富集分析發現，氧化磷酸化通路顯著富集，GO富集分析顯示線粒體呼吸鏈復合體I顯著富集（圖4D和E）。這些結果表明Hmgb2可能參與精子發生細胞中的ATP合成。ATP水解是真核細胞中代謝能量的主要來源，ATP檢測試驗顯示Hmgb2敲低后細胞內ATP水平降低（圖4F）。進一步實驗結果表明，PM2.5暴露的GC-2spd細胞中ATP水平降低（圖4G）。通過qRT-PCR驗證轉錄組富集的氧化磷酸化基因在Hmgb2敲低和PM2.5處理的GC-2spd細胞中的表達確實受到干擾。研究者驗證了PM2.5誘導的ATP降低可以通過過表達Hmgb2來逆轉（圖4H和I）。這些數據表明Hmgb2可能調控精子發生細胞中的ATP水平，從而影響精子運動能力。
圖4：Hmgb2調控GC-2spd細胞中的ATP水平。
(A-B) 對照組和轉染siHMGB2的細胞中HMGB2蛋白的表達及定量分析（n=3）。
(C) GC-2spd細胞轉染siHMGB2后轉錄組測序結果的火山圖。
(D) RNA-seq中差異表達基因的KEGG分析圖。
(E) RNA-seq的GO富集分析結果。
(F) siHMGB2處理后GC-2spd細胞中的ATP水平。
(G) PM2.5暴露后細胞中的ATP水平。
(H) HMGB2-OE質粒處理后的HMGB2蛋白表達。
(I) 有無PM2.5處理時，HMGB2-OE質粒處理后GC-2spd細胞中的ATP水平。
（5）PM2.5誘導的m6A修飾可能主要由m6A甲基轉移酶WTAP下調引起
差異m6A修飾受m6A甲基轉移酶和去甲基轉移酶調控。為探索PM2.5暴露小鼠雄性生殖系統中m6A甲基轉移酶和去甲基轉移酶是否差異表達，研究者檢測了甲基轉移酶（METTL3、METTL4和WTAP）和去甲基轉移酶（FTO和ALKBH5）的mRNA表達。結果表明，PM2.5暴露小鼠睪丸中m6A甲基轉移酶WTAP表達顯著降低，而PM2.5對m6A去甲基轉移酶mRNA表達無影響（圖5A）。在PM2.5暴露的GC-2spd細胞中也得到一致結果（圖5B）。此外，WTAP蛋白在PM2.5暴露的睪丸組織和GC-2spd細胞中的表達顯著降低（圖5C-F）。同時，WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在很高的互作概率。
圖5：PM2.5暴露后GC-2spd細胞和睪丸中m6A甲基轉移酶和去甲基轉移酶的表達檢測。
(A-B) 小鼠睪丸（A）和GC-2spd細胞（B）中甲基轉移酶和去甲基轉移酶的mRNA表達（n=3）。
(C) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的表達。
(D) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細胞中WTAP蛋白的表達。
(F) GC-2spd細胞中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
（6）WTAP通過m6A修飾調控PM2.5誘導的Hmgb2表達降低
接下來，研究者進一步確認Hmgb2表達是否受甲基轉移酶WTAP的調控。首先通過RNA免疫沉淀實驗（RIP）結果表明，與陰性對照IgG相比，抗WTAP抗體在Hmgb2中顯著富集（圖6A），表明WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在互作。使用siRNA敲低Wtap后，GC-2spd細胞中Hmgb2 mRNA表達顯著降低，蛋白表達驗證結果也一致（圖6B-D）。為研究m6A修飾的具體調控作用，研究者進行MeRIP-qRT-PCR實驗。根據MeRIP-Seq結果設計特異性引物，發現敲低Wtap導致Hmgb2的m6A修飾水平降低（圖6E）。進一步構建過表達Wtap的細胞系，結果顯示過表達Wtap后GC-2spd細胞中Hmgb2的m6A修飾顯著提高（圖6F）。研究者還證明PM2.5誘導的Hmgb2降低可以通過過表達Wtap來逆轉（圖6G和H）。為驗證Wtap是否通過m6A修飾調控Hmgb2 mRNA穩定性，研究者進行RNA穩定性實驗。結果表明敲低Wtap加速Hmgb2 mRNA降解（圖6I）。總體而言，這些結果表明PM2.5誘導的Hmgb2低表達是由于WTAP通過m6A修飾調控的Hmgb2 mRNA穩定性降低所致。
圖6：WTAP通過m6A修飾調控Hmgb2 mRNA的穩定性。
(A) 通過RNA免疫沉淀（RIP）分析WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA的互作（n=3）。
(B) 轉染siWTAP后GC-2spd細胞中Wtap和Hmgb2 mRNA表達的驗證（n=3）。
(C) siWTAP處理后細胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達。
(D) siWTAP處理后WTAP和HMGB2蛋白表達的定量分析（n=3）。
(E) siWTAP-3處理對GC-2spd細胞中Hmgb2的m6A修飾的影響（n=3）。
(F) Wtap過表達后GC-2spd細胞中Hmgb2的m6A修飾水平（n=3）。
(G) 有無PM2.5處理時，對照組和WTAP-OEGC-2spd細胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達水平。
(H) WTAP和HMGB2蛋白的定量分析（n=3）。
(I) 與siNC組相比，有無siWTAP處理時GC-2spd細胞中Hmgb2 mRNA的穩定性（n=3）。
結論和啟示
本研究從m6A修飾的表觀遺傳學角度為理解PM2.5的雄性生殖毒性提供了新的視角。PM2.5暴露后，m6A甲基轉移酶WTAP表達降低，導致Hmgb2 mRNA穩定性降低（通過降低Hmgb2的m6A修飾），進而影響精子發生細胞中的ATP水平，最終導致精子運動能力下降。本研究揭示了PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮受損和精子運動能力下降的現象，并闡明了m6A修飾在PM2.5暴露導致的精子發生細胞損傷中的作用。
MeRIP-Seq在本研究中的作用
本研究通過MeRIP-Seq技術全面揭示了PM2.5暴露對睪丸組織m6A修飾的影響，并進一步通過實驗驗證了關鍵基因Hmgb2的m6A修飾變化及其功能。這一發現提示，在未來類似的污染環境暴露研究中，m6A修飾檢測技術（如MeRIP-Seq）可以作為一種強有力的工具，用于探索環境因素對生物體基因表達和生理功能的影響機制，為開發靶向干預措施提供理論依據。
參考文獻：
Wang J, Zhang Z, Shi F, Li Y, Shi C, Wang T, Sun L, Ao L, Han F, Chen Q, Cao J, Liu J. WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure. Environ Pollut. 2025 Feb 21:125896. doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896.
標題：WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure（WTAP介導的Hmgb2 m6A修飾促進PM2.5暴露誘導的精子發生損傷）
發表時間：2025年4月1日
發表期刊：Environmental Pollution
影響因子：IF7.3/Q1
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術）
作者單位：陸軍軍醫大學軍事預防醫學系王建康、張中豪、劉晉?t等
doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896
N6-甲基腺苷（m6A）廣泛參與復雜的精子發生過程，同時對環境暴露極為敏感。眾多研究表明，細顆粒物（PM2.5）對男性生殖系統具有毒性，但其中涉及的具體表觀遺傳機制尚未得到充分研究。本研究通過構建實時PM2.5暴露的小鼠模型和GC-2spd細胞系，研究了m6A修飾對PM2.5誘導的男性生殖功能障礙的影響。結果表明，PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮受損、精母細胞線粒體異常以及精子運動能力顯著下降。MeRIP-seq基因富集分析結果表明，與對照組相比，經PM2.5處理的小鼠睪丸組織中差異m6A修飾基因在精子發生過程中顯著富集，且甲基轉移酶WTAP表達在PM2.5暴露后顯著降低。此外，PM2.5暴露導致精子發生相關基因Hmgb2表達以及Hmgb2 m6A修飾水平顯著降低。轉錄組測序（RNA-seq）及驗證實驗表明，Hmgb2可能調控精母細胞中的ATP（腺苷三磷酸）水平。研究還證實m6A甲基轉移酶WTAP通過m6A修飾影響Hmgb2 mRNA穩定性。本研究為理解PM2.5對精子發生損害以及精子運動能力降低提供了新見解。
研究圖形摘要
研究方法
動物實驗：8周齡實驗小鼠隨機分為三組，分別暴露于高濃度環境顆粒物（CAP，483.6μg/m3）、正常環境未過濾空氣（UA，59.8μg/m3）和過濾空氣（FA，0.4μg/m3）中，每組8只小鼠。暴露結束后，對小鼠睪丸進行組織學檢查、精子運動能力檢測、超微結構觀察等。
細胞實驗：使用小鼠來源的精母細胞（GC-2spd體外細胞系）進行細胞實驗，將 PM2.5標準物質SRM1648a制備PM2.5股溶液（5mg/mL），選擇 0、25、50、100μg/mL 四個濃度的 PM2.5進行細胞實驗。
基因敲低與過表達：分別對Wtap和Hmgb2進行過表達和敲低操作。
轉錄組測序：對Hmgb2敲低的GC-2spd 細胞進行轉錄組測序（RNA-seq），分析RNA表達變化。
MeRIP-Seq：對睪丸組織的m6A RNA免疫沉淀測序，檢測不同組暴露小鼠的m6A甲基化水平變化。
特定位點m6A修飾檢測（MeRIP - qRT - PCR）：根據 MeRIP-Seq結果設計特異性引物進行 qRT - PCR 檢測特定位點 m6A修飾水平。
結果圖形
（1）PM2.5暴露導致精子細胞損傷和精子運動能力下降
研究者構建了實時PM2.5暴露的小鼠模型，通過組織學檢查發現PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮受損，表現為增加的空泡化和精子細胞排列紊亂（圖1A）。對VII期精子發生小管中的細胞計數顯示，PM2.5暴露后，粗線期精母細胞數量顯著減少，而精原細胞和圓形精子數量雖有下降趨勢，但差異未達到統計學意義，支持細胞數量未發生顯著變化（圖1B-E）。超微結構觀察顯示，PM2.5暴露后，精母細胞線粒體受損，表現為線粒體嵴減少和外膜破裂（圖1F），提示精母細胞是PM2.5暴露的關鍵靶細胞。此外，通過計算機輔助精子分析系統（CASA）分析小鼠精子運動能力，與過濾空氣（FA）組相比，正常環境（UA）組精子運動能力相關參數（總精子運動能力、超激活、PR和VSL）呈現下降趨勢，但差異未達到統計學意義，而高濃度環境顆粒物（CAP）組所有參數均顯著下降（圖1G-J）。這些結果表明PM2.5暴露對小鼠精子發生和運動能力產生了明顯負作用。
圖1：PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮損傷和精子運動能力下降。 A 睪丸組織HE染色切片的代表性圖像。
(B-E) VII期精子發生小管中的精子細胞計數，包括精原細胞（B）、粗線期精母細胞（C）、圓形精子（D）和Sertoli細胞（E）（n=8）。
(F) 睪丸超微結構的代表性圖像。紅色箭頭線：受損的線粒體（嵴減少和外膜破裂）。
(G-J) 通過CASA測量的精子運動能力相關參數，包括總精子運動能力（G）、前向運動能力（PR，H）、直線速度（VSL，I）和精子超活化（J）（n=8）。
（2）PM2.5暴露誘導睪丸m6A甲基化圖譜變化
為深入了解m6A修飾在PM2.5誘導的雄性生殖損傷中的作用，研究者對睪丸組織細胞中的RNA m6A進行高通量測序（MeRIP-seq）。在FA組中，m6A修飾基因主要在精子發生、精子與透明帶結合以及精子細胞發育等過程中富集，表明m6A修飾在正常雄性生殖過程中發揮功能（圖2A）。進一步分析差異甲基化區域（DMRs，P<0.05），結果表明與FA組相比，CAP組有152個顯著上調甲基化區域和105個顯著下調甲基化區域，而UA組與FA組之間有298個上調區域和85個下調區域（圖2B）。這些DMRs主要位于mRNA結構的CDS和3'UTR區域（圖2C）。對DMRs的motif分析顯示，CAP組和FA組的DMRs主要出現在HGACC等motif中，而UA組和FA組的DMRs主要出現在HCGAH等motif中（圖2D）。對CAP、UA和FA組中差異m6A修飾基因的功能富集分析顯示，精子發生過程顯著富集（圖2E和F）。這些結果表明m6A修飾可能參與PM2.5誘導的雄性生殖損傷過程。MeRIP-Seq技術在這一部分發揮關鍵作用，其對RNA上的m6A修飾進行高通量測序，從而全面揭示PM2.5暴露后睪丸組織中m6A修飾的整體變化情況，為后續尋找關鍵靶基因提供基礎。
圖2：CAP、UA和FA組睪丸轉錄組范圍內的差異m6A甲基化特征。
(A) FA組中m6A修飾基因的基因本體（GO）富集分析。
(B) 差異m6A修飾peaks分析。
(C) 差異甲基化區域（DMRs）在mRNA上的分布模式。
(D) DMRs的motif分析。（R=A/G，H=A/C/U）
(E-F) CAP組與FA組（E）以及UA組與FA組（F）中不同m6A修飾基因的生物過程富集分析。
（3）Hmgb2是一個關鍵的差異表達m6A修飾精子發生相關基因
研究者進一步分析了FA、UA和CAP組之間的差異m6A修飾精子發生相關基因的交集，共鑒定出10個潛在關鍵基因（Hmgb2、Tdrd5、Hspa1l、Bag6、Setx、Pax5、Map7、Dnm2、Chd5和PIwil1）。對這些基因在小鼠睪丸中的mRNA表達水平進行驗證分析，結果表明Hmgb2和Piwil1在PM2.5暴露小鼠睪丸中顯著下調，而Tdrd5顯著上調（圖3A）。在GC-2spd細胞中存在類似結果（圖3B）。HMGB2蛋白在PM2.5暴露小鼠睪丸中的表達顯著降低（圖3C和D），但在體外模型中，HMGB2蛋白水平在PM2.5處理后也顯著下調（圖3E和F）。MeRIP-Seq結果顯示，PM2.5暴露后睪丸組織中Hmgb2的m6A修飾減少（圖3G），這一結果在體外模型中也得到進一步驗證（圖3H）。基于這些數據，研究者將關注點聚焦于Hmgb2基因。MeRIP-Seq不僅能夠檢測到Hmgb2基因m6A修飾變化，還精確定位修飾發生的具體區域，為后續研究Hmgb2基因m6A修飾的功能提供重要依據。
圖3：PM2.5暴露后GC-2spd細胞和睪丸中Hmgb2表達下調。
(A-B) 小鼠睪丸（A）和GC-2spd細胞（B）中10個關鍵差異m6A修飾的精子發生相關基因mRNA表達（n=3）。
(C) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白的表達。
(D) 小鼠睪丸中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細胞中HMGB2蛋白的表達。
(F) 細胞中HMGB2蛋白水平的定量分析（n=3）。
(G) 小鼠睪丸中Hmgb2 mRNA甲基化峰的可視化。
(H)通過MeRIP-qRT-PCR檢測PM2.5暴露對GC-2spd細胞中Hmgb2 m6A修飾的作用（n=3）。
（4）Hmgb2下調介導小鼠精子發生細胞中的ATP水平變化
Hmgb2在精子發生和精子運動能力中的具體功能尚不清楚。研究者構建了Hmgb2敲低的GC-2spd細胞系并進行RNA-seq轉錄組測序，共鑒定出199個差異表達基因（DEGs），包括145個上調基因和54個下調基因（圖4C）。對這些DEGs進行通路富集分析發現，氧化磷酸化通路顯著富集，GO富集分析顯示線粒體呼吸鏈復合體I顯著富集（圖4D和E）。這些結果表明Hmgb2可能參與精子發生細胞中的ATP合成。ATP水解是真核細胞中代謝能量的主要來源，ATP檢測試驗顯示Hmgb2敲低后細胞內ATP水平降低（圖4F）。進一步實驗結果表明，PM2.5暴露的GC-2spd細胞中ATP水平降低（圖4G）。通過qRT-PCR驗證轉錄組富集的氧化磷酸化基因在Hmgb2敲低和PM2.5處理的GC-2spd細胞中的表達確實受到干擾。研究者驗證了PM2.5誘導的ATP降低可以通過過表達Hmgb2來逆轉（圖4H和I）。這些數據表明Hmgb2可能調控精子發生細胞中的ATP水平，從而影響精子運動能力。
圖4：Hmgb2調控GC-2spd細胞中的ATP水平。
(A-B) 對照組和轉染siHMGB2的細胞中HMGB2蛋白的表達及定量分析（n=3）。
(C) GC-2spd細胞轉染siHMGB2后轉錄組測序結果的火山圖。
(D) RNA-seq中差異表達基因的KEGG分析圖。
(E) RNA-seq的GO富集分析結果。
(F) siHMGB2處理后GC-2spd細胞中的ATP水平。
(G) PM2.5暴露后細胞中的ATP水平。
(H) HMGB2-OE質粒處理后的HMGB2蛋白表達。
(I) 有無PM2.5處理時，HMGB2-OE質粒處理后GC-2spd細胞中的ATP水平。
（5）PM2.5誘導的m6A修飾可能主要由m6A甲基轉移酶WTAP下調引起
差異m6A修飾受m6A甲基轉移酶和去甲基轉移酶調控。為探索PM2.5暴露小鼠雄性生殖系統中m6A甲基轉移酶和去甲基轉移酶是否差異表達，研究者檢測了甲基轉移酶（METTL3、METTL4和WTAP）和去甲基轉移酶（FTO和ALKBH5）的mRNA表達。結果表明，PM2.5暴露小鼠睪丸中m6A甲基轉移酶WTAP表達顯著降低，而PM2.5對m6A去甲基轉移酶mRNA表達無影響（圖5A）。在PM2.5暴露的GC-2spd細胞中也得到一致結果（圖5B）。此外，WTAP蛋白在PM2.5暴露的睪丸組織和GC-2spd細胞中的表達顯著降低（圖5C-F）。同時，WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在很高的互作概率。
圖5：PM2.5暴露后GC-2spd細胞和睪丸中m6A甲基轉移酶和去甲基轉移酶的表達檢測。
(A-B) 小鼠睪丸（A）和GC-2spd細胞（B）中甲基轉移酶和去甲基轉移酶的mRNA表達（n=3）。
(C) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的表達。
(D) 小鼠睪丸中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
(E) GC-2spd細胞中WTAP蛋白的表達。
(F) GC-2spd細胞中WTAP蛋白的定量分析（n=3）。
（6）WTAP通過m6A修飾調控PM2.5誘導的Hmgb2表達降低
接下來，研究者進一步確認Hmgb2表達是否受甲基轉移酶WTAP的調控。首先通過RNA免疫沉淀實驗（RIP）結果表明，與陰性對照IgG相比，抗WTAP抗體在Hmgb2中顯著富集（圖6A），表明WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA之間存在互作。使用siRNA敲低Wtap后，GC-2spd細胞中Hmgb2 mRNA表達顯著降低，蛋白表達驗證結果也一致（圖6B-D）。為研究m6A修飾的具體調控作用，研究者進行MeRIP-qRT-PCR實驗。根據MeRIP-Seq結果設計特異性引物，發現敲低Wtap導致Hmgb2的m6A修飾水平降低（圖6E）。進一步構建過表達Wtap的細胞系，結果顯示過表達Wtap后GC-2spd細胞中Hmgb2的m6A修飾顯著提高（圖6F）。研究者還證明PM2.5誘導的Hmgb2降低可以通過過表達Wtap來逆轉（圖6G和H）。為驗證Wtap是否通過m6A修飾調控Hmgb2 mRNA穩定性，研究者進行RNA穩定性實驗。結果表明敲低Wtap加速Hmgb2 mRNA降解（圖6I）。總體而言，這些結果表明PM2.5誘導的Hmgb2低表達是由于WTAP通過m6A修飾調控的Hmgb2 mRNA穩定性降低所致。
圖6：WTAP通過m6A修飾調控Hmgb2 mRNA的穩定性。
(A) 通過RNA免疫沉淀（RIP）分析WTAP蛋白與Hmgb2 mRNA的互作（n=3）。
(B) 轉染siWTAP后GC-2spd細胞中Wtap和Hmgb2 mRNA表達的驗證（n=3）。
(C) siWTAP處理后細胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達。
(D) siWTAP處理后WTAP和HMGB2蛋白表達的定量分析（n=3）。
(E) siWTAP-3處理對GC-2spd細胞中Hmgb2的m6A修飾的影響（n=3）。
(F) Wtap過表達后GC-2spd細胞中Hmgb2的m6A修飾水平（n=3）。
(G) 有無PM2.5處理時，對照組和WTAP-OEGC-2spd細胞中WTAP和HMGB2蛋白的表達水平。
(H) WTAP和HMGB2蛋白的定量分析（n=3）。
(I) 與siNC組相比，有無siWTAP處理時GC-2spd細胞中Hmgb2 mRNA的穩定性（n=3）。
結論和啟示
本研究從m6A修飾的表觀遺傳學角度為理解PM2.5的雄性生殖毒性提供了新的視角。PM2.5暴露后，m6A甲基轉移酶WTAP表達降低，導致Hmgb2 mRNA穩定性降低（通過降低Hmgb2的m6A修飾），進而影響精子發生細胞中的ATP水平，最終導致精子運動能力下降。本研究揭示了PM2.5暴露導致小鼠精子發生上皮受損和精子運動能力下降的現象，并闡明了m6A修飾在PM2.5暴露導致的精子發生細胞損傷中的作用。
MeRIP-Seq在本研究中的作用
本研究通過MeRIP-Seq技術全面揭示了PM2.5暴露對睪丸組織m6A修飾的影響，并進一步通過實驗驗證了關鍵基因Hmgb2的m6A修飾變化及其功能。這一發現提示，在未來類似的污染環境暴露研究中，m6A修飾檢測技術（如MeRIP-Seq）可以作為一種強有力的工具，用于探索環境因素對生物體基因表達和生理功能的影響機制，為開發靶向干預措施提供理論依據。
參考文獻：
Wang J, Zhang Z, Shi F, Li Y, Shi C, Wang T, Sun L, Ao L, Han F, Chen Q, Cao J, Liu J. WTAP-mediated m6A modification of Hmgb2 contributes to spermatogenic damage induced by PM2.5 exposure. Environ Pollut. 2025 Feb 21:125896. doi: 10.1016/j.envpol.2025.125896.
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