孔雀石綠（Malachite Green，MG）是一種人工合成的三苯甲烷類染料，曾被廣泛用于水產養殖的殺菌和抗寄生蟲，但因其代謝產物（無色孔雀石綠，LMG）具有高毒性、致畸性和潛在致癌性，已被多國列為水產食品禁用物質。孔雀石綠單克隆抗體（Anti-Malachite Green Monoclonal Antibody）憑借對 MG 及 LMG 的特異性識別能力，成為水產食品中孔雀石綠殘留檢測的核心工具，在食品安全監管中應用廣泛。以下從制備、特性及應用展開說明：

一、孔雀石綠單克隆抗體的制備
孔雀石綠為小分子化合物（分子量 364.9 Da），無免疫原性，需通過 半抗原 - 載體蛋白偶聯激發免疫反應，具體流程如下：
1. 半抗原設計與偶聯
孔雀石綠的分子結構含三苯甲烷骨架，其中 中央碳原子連接的二甲氨基（-N (CH?)?） 和 苯環取代基是其特異性表位的關鍵，偶聯需保留這些特征：

• 位點選擇：孔雀石綠本身無羧基或氨基等活性基團，需通過化學衍生化引入反應位點 —— 常用還原法將 MG 的季銨鹽結構轉化為叔胺（如生成羥基衍生物），或通過苯環上的取代基（如羥基）進行修飾，避免破壞二甲氨基這一核心識別位點；
• 偶聯方法：采用碳二亞胺法（EDC）或戊二醛法，將衍生化的 MG 半抗原與載體蛋白偶聯。免疫原優先選擇鑰孔血藍蛋白（KLH，增強免疫原性），包被原選擇卵清蛋白（OVA），且兩者需用不同載體，減少對載體蛋白的非特異性抗體干擾。

2. 雜交瘤細胞株的構建與篩選

• 免疫方案：將 MG-KLH 偶聯物免疫 Balb/c 小鼠，初次免疫用弗氏完全佐劑乳化，后續加強免疫用弗氏不完全佐劑，每 2-3 周一次。通過間接 ELISA 檢測血清效價，當效價＞1:10?且對 MG 的結合能力強時，選取高免小鼠進行細胞融合；
• 細胞融合：取小鼠脾臟淋巴細胞與骨髓瘤細胞（如 SP2/0）經 PEG（分子量 1500）融合，用 HAT 培養基篩選存活的雜交瘤細胞（淘汰未融合細胞）；
• 陽性克隆篩選：采用間接競爭 ELISA，以 MG 標準品為競爭原，重點篩選對 MG 和 LMG（代謝產物）結合能力強（IC??低）、且與其他三苯甲烷類染料（如結晶紫、亞甲基藍）交叉反應率低的克隆株。經 3-4 次有限稀釋法克隆化，獲得穩定分泌單克隆抗體的細胞株。

3. 抗體純化

從雜交瘤細胞培養上清或小鼠腹水中提取抗體，通過蛋白 A/G 親和層析法純化，純度可達 95% 以上，滿足痕量檢測需求（水產中限量通常為 μg/kg 級）。

二、抗體的核心特性
1. 特異性（交叉反應與代謝物識別）

• 對代謝物的識別：孔雀石綠在生物體內快速還原為無色孔雀石綠（LMG），且 LMG 毒性更強、殘留時間更長，因此優質抗體需同時高效識別 MG 和 LMG（交叉反應率＞80%），避免漏檢；
• 與其他染料的區分：需排除結晶紫、甲基紫等結構類似物的干擾，理想抗體對這類物質的交叉反應率應＜1%，確保檢測特異性。

2. 靈敏度

孔雀石綠在水產中的殘留限量嚴格（如我國規定魚類中≤0.01 mg/kg），因此抗體需具備高靈敏度：

 

• 關鍵指標：半數抑制濃度（IC??）通常為 0.1-1 ng/mL，檢測下限（LOD）＜0.05 ng/mL，可滿足痕量殘留檢測需求；
• 穩定性：4℃可保存 6 個月以上，-20℃凍存可穩定 1 年以上，避免反復凍融（建議分裝保存）。

三、主要應用場景

1. 水產食品檢測

   • ELISA 試劑盒：基于競爭法原理，樣本中的 MG/LMG 與酶標 MG 競爭結合抗體，通過吸光度變化定量檢測魚類、蝦、蟹等水產中的殘留量，適用于實驗室批量篩查（單次檢測約 2 小時，批內變異系數＜5%）；
   • 膠體金試紙條：將抗體固定于檢測線，5-10 分鐘完成定性 / 半定量分析，檢測限＜0.1 ng/mL，適用于養殖場、批發市場、海關的現場快速篩查。

2. 養殖環境監測
   檢測養殖水體、飼料中的孔雀石綠殘留，追溯污染來源，評估養殖環節的合規性。

3. 監管與溯源
   作為食品安全國家標準檢測方法（如 GB/T 19857-2005）的核心試劑，支撐市場監管部門的抽檢工作，打擊非法使用孔雀石綠的行為。

孔雀石綠單克隆抗體的制備需通過精準的半抗原衍生化保留其核心結構（尤其是二甲氨基），并確保對代謝物 LMG 的高效識別。該抗體作為高特異性、高靈敏度的檢測工具，在水產食品安全監管中不可或缺，為控制孔雀石綠殘留風險、保障消費者健康提供了關鍵技術支持。