腦類器官使得人類大腦發育的機制研究成為可能，并提供了在不受限制的發育系統中探索自我組織形成的機會， 類器官的成像觀察是理解其微觀結構和功能的重要手段（文獻1）。由于人腦類器官的尺寸較大，組織致密，發育緩慢，且在幾周到幾個月的發育過程中需要無菌成像條件，使得對人腦類器官的活體成像特別是長時間，面臨巨大挑戰。

在本例中，作者 建立了長期的活體光片顯微鏡技術，應用于由熒光標記的人類誘導多能干細胞生成的無指導腦類器官，這使得我們能夠在類器官發育的數周內跟蹤組織形態、細胞行為和亞細胞特征，為研究人類大腦形態動力學提供了新的途徑，并支持基質相關的機械感知動態在大腦區域化過程中發揮核心作用的觀點。

稀疏和多位點熒光標記腦類器官的
長期活體成像

01、類器官的培養
本研究中使用的細胞系為：

Histone2B-mEGFP 均勻標記細胞核
mEGFP-Beta-Actin 均勻標記 ACTB
mTagRFP–T–CAAX 標記細胞膜
mTagRFP–T-LaminB1 標記 LMNB1
未標記的 WTC iPSCs

操作流程：

• 干細胞系按標準流程培養和傳代
• 96孔板，每孔加入500個細胞/3000個細胞，在 mTSR+中（加入1:200 ROCKi和1:200Pen-strep），并以 200g離心5分鐘以生成胚體（EBs）
• 在第 2 天更換新鮮的 mTSR+，加入1:200 ROCKi 和 1:200 Pen-strep
• 第 4 天提供含 2%溶解的 matrigel 的新鮮神經誘導培養基，并每隔一天更換一次
• 第 10 天提供含 2% matrigel 的分化培養基-VitA，并在第 15 天提供含 1% matrigel 的分化培養基+ VitA
• 第 15 天將類器官轉移到 24 孔板中，每孔一個類器官，并轉移到搖床上，隨后在一個月時將每孔一個類器官轉移到 6 孔板中，并保持在搖床上
• ?嵌入基質膠中，并培養在樣本室微孔中的細胞球用于光片成像

圖1.腦類器官培養 a)本研究開發的流程示意圖（流程I）和之前的多區域人腦類器官（流程II）b)在兩種細胞接種濃度下，聚集后第4天類器官大小的比較，比例尺為500μm c)顯示在兩種不同的流程下，第8-11天類器官生長的名稱圖像 d)樣品保持室的照片，包含四個分隔的子室，每個子室有四個微孔，用于生長和成像16個不用的類器官，每個微孔一個。

02、長期活體成像觀察

胚胎體（4 個）嵌入溶解在神經誘導培養基中的 20-50%基質膠中或覆蓋在 0.6%的低熔點瓊脂糖上。

圖2.稀疏和多位點熒光標記腦類器官的長期活體成像.f、4 個不同類器官（第 15 天）的 3D 投影（左）和橫截面（右），用全切片熒光原位雜交鏈反應（HCR）染色標記轉錄本。比例，100 微米。g) 從 188 小時成像實驗中 75 小時成像的最大投影圖像。類器官包含 5 種不同的細胞系，這些細胞系具有穩定的蛋白質遺傳標記，使用紅色或綠色熒光蛋白（RFP，GFP），以及未標記的細胞。比例，100 微米。h) 組織器切片（84 小時）顯示核膜（Lamin，RFP，品紅色）、質膜標記（CAAX，RFP，品紅色）、肌動蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，品紅色）和細胞核（組蛋白，GFP，綠色）。i) 不同時間點的圖像顯示最大強度投影（左半部分）和切片（右半部分）。

每兩天更換一次培養基。成像使用 Viventis LS1 Live 光片顯微鏡進行，具體設置如下：

• 物鏡——25X NA1.1水鏡
• 成像視野——710μm
• xy 像素大小——0.347μm
• Z軸步徑——2μm，201 步
• ?采集幀率為——30 分鐘 

外源性細胞外基質影響大腦類
器官的形態發生

為了量化類器官之間的形態動態變化，作者利Viventis LS2光片顯微鏡低光毒性、多位點、多視角的成像能力，一次成像并行記錄16個類器官通過統計分析不同時間點類器官體積、腔室體積和腔室數量，結果突出了早期大腦類器官發育的三個形態動力學階段，包括：

快速組織和腔體生長的早期階段
涉及腔體融合事件的組織穩定階段
神經上皮成熟的最終階段

對比用基質膠、低熔點瓊脂糖和不使用任何外源基質培養類器官，使用光片長時間跟蹤類器官動力學，結果顯示外源細胞外基質的存在對人腦類器官的組織尺度形態發生有重大影響，且改變的組織極性可能會影響成熟神經上皮中的細胞形態動力學。

 

圖3.外源性細胞外基質對大腦類器官形態發生的影響。a) 類器官投影（第 7 天）顯示 16 個同時圖像采集，展示核膜（Lamin，RFP，橙色）、質膜標記（CAAX，RFP，橙色）、肌動蛋白（GFP，青色）、微管蛋白（RFP，橙色）和細胞核（組蛋白，GFP，青色）。最大投影（左）和橫截面（右）b) 來自同一類器官在不同時間點的靜態圖，顯示橫截面并突出腔體形態（虛線）c) 類器官的橫截面顯示分段腔體和類器官上皮分割圖。d) 第 4-9 天每天測量的類器官總體積e) 圖表顯示隨時間變化的所有腔體的總體積f) 圖表顯示隨時間變化的分段腔體總數的變化。g) 類器官的橫截面顯示腔體形成和融合的過程m) 細胞外微環境的示意圖及與之對應的明場圖像，顯示用 Matrigel（外部 ECM）培養的類器官、沒有任何外部嵌入（內部 ECM）和低熔點瓊脂嵌入（擴散屏障）。n) 示意圖顯示光片實驗設置，以獲取不同嵌入處理的 16 倍類器官的同步成像。o) 第 9 天的圖像靜幀，顯示沒有任何嵌入和帶有瓊脂擴散屏障的類器官的最大投影（左）和橫截面（右）。p) 用 Matrigel 培養的類器官、沒有基質和帶有擴散屏障的類器官中分段腔的 3D 渲染。q-r) 圖表顯示從第 4 天到第 9 天每天測量的所有成像類器官的總體積（q）、分段腔的總數變化（r）以及所有腔的總容量隨時間的變化（s）誤差條表示標準差。t) 圖像顯示了在使用基質膠或無基質生長的類器官（第 15 天）上進行免疫組化實驗的橫截面，并染色以顯示細胞核（DAPI）、COL4A1 和 CDH2。所有圖像的比例尺為 100 μm。

單細胞形態類型分析揭示了發育中的
類器官內形狀的轉變

研究人員利用多位點標記的質膜、肌動蛋白、微管、核膜和組蛋白評估細胞形態變化在早期大腦類器官發育過程中對細胞的影響。通過開發的圖像分析流程：圖像預處理→亞細胞結構分割→結構預測→特征提取→解多通道→形態特征分析，揭示了兩個主要的核（組蛋白、層粘連蛋白）和細胞（肌動蛋白、微管、膜）結構組。

通過高分辨率聚類，將結構分組為形態類型，即具有相似形態特征（如體積、曲率、軸長的細胞簇，使用PAGA軌跡分析識別組織中的結構變化梯度，量化了多能干細胞向早期神經外胚層的過渡，基于細胞結構形態和組織拓撲變化形成成熟的神經上皮。

通過對每種基質條件（基質膠、瓊脂糖和無外源基質）下，對每一天成像的類器官進行標記結構的分割以及形態學分類分析，結果表明在沒有基質膠作為外部細胞外基質的情況下生成的類器官在組織拓撲上發生了變化，包含更大比例的非排列和非延長細胞，細胞形態類型的異質性更高，并且未形成均勻的神經外胚層和神經上皮。

圖4. 使用接多路多位點細胞標簽的細胞和細胞核形態轉變。a)分析策略示意圖。b) 第 6 天的類器官最大強度投影，標記有核膜（Lamin，RFP，粉色）、質膜（CAAX，RFP，粉色）、肌動蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，粉色）和細胞核（組蛋白，GFP，綠色）c) 解通道圖像（Lamin，深棕色；CAAX，橙色；肌動蛋白，藍色；微管蛋白，品紅色；組蛋白，綠色） d) 基于形態特征提取的所有解多通道標簽的 PAGA 初始化 UMAP 嵌入。e) PAGA 初始化 UMAP 嵌入顯示肌動蛋白、微管蛋白和 CAAX 標簽的軸長變化，以及使用組蛋白和 Lamin 分割測量的細胞核體積變化。PAGA 圖顯示平均簇年齡（天數）的變化，節點大小表示一個簇內的細胞數量，邊寬反映兩個簇之間的連接強度。f) 在 matrigel 條件下，所有細胞（肌動蛋白）按其對齊指數（與最近的類器官表面法線的絕對余弦角）著色。比例范圍為 0-1，其中 1（紅色）對應于與類器官表面垂直對齊的細胞。g) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入和 PAGA 圖顯示使用從基質膠、無基質和瓊脂糖條件下分割的細胞的細胞形態類型聚類。圖基于提取的所有分割細胞（肌動蛋白）的形態測量。h) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入顯示細胞軸比隨時間變化，并疊加顯示使用 PAGA 圖的平均聚類年齡。PAGA 圖根據聚類的平均年齡從淺灰色到黑色進行顏色編碼。i) 每個形態類型聚類的示例細胞（肌動蛋白）。j) 顯示標記有肌動蛋白的細胞的類器官示例圖像，顯示按其形態類型聚類著色的細胞。k) 堆疊條形圖顯示在基質膠、無基質和瓊脂糖條件下各個肌動蛋白形態類型聚類中細胞的比例。l) 圖像顯示在第 6 天基質膠條件下的細胞（肌動蛋白）根據細胞對齊指數著色，以及在第 9 天無基質和瓊脂糖條件下的細胞。m) 小提琴圖顯示在第 4 天到第 12 天所有三種條件下所有分割細胞的細胞對齊（肌動蛋白）值。n) 線圖顯示在三種條件下香農指數的變化，基于隨時間變化的每個簇的細胞數量（基質膠 (n=3)、無基質 (n=3) 和瓊脂糖 (n=3)）。

矩陣通過調節 WNT 通路影響類器官的
形態發生和模式形成

為了理解在不同基質條件（基質膠、瓊脂糖、無矩陣）下生長的類器官中發展出的分子細胞狀態，我們對第 13 天的類器官進行了單細胞轉錄組分析，差異表達基因的基因本體分析顯示出多個信號通路的富集，包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信號通路以及與肌動蛋白細胞骨架調節相關的基因。

基質膠誘導的神經外胚層的強烈形態變化，以及在無基質條件下 WNT 和 Hippo 信號通路的上調，測試了YAP調節對類器官發育的影響。綜合證實了我們應用含有外部基底膜豐富的 ECM 的 matrigel，導致腔體擴張并自我模式化為主要的頭側前腦區域，并且 YAP1 的激活和 WLS 表達水平的增加促進了發育中的神經上皮的尾部化。

在對人類早期腦類器官的形態動力學研究中，Viventis LS2 Live光片顯微鏡以極低的光毒性，通過多視角、多位置、長時程的活細胞成像，展現腦類器官的整個發育過程。在單次長時程成像過程中，同時收集多個樣本在不同條件下的數據，結合自我開發的分析流程、單細胞轉錄組分析、信號通路探索分析，展示了YAP1 在基質介導的形態發生和類器官模式化中發揮的作用。

總的來說，這一應用案例為理解類器官發育的形態動力學提供了技術進步，提供了對基質介導的神經上皮信號通路的機制性見解，并為未來探索人類大腦發育過程中細胞外微環境鋪平了道路。

參考文獻：
1.Method of the Year 2017: Organoids. (2018). Nature Methods
2.Elke Gabriel et.al Human brAIn organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles Cell Stem Cell 28, 1740–1757, October 7, 2021
3.Akanksha Jain et.al Morphodynamics of human early brain organoid development bioRxiv | August 21, 2023

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