在重組蛋白表達和純化過程中，為了便于純化和檢測，通常會在目的蛋白上添加親和標簽（affinity tag）。其中，FLAG (DYKDDDDK, DDDDK等)標簽是常用的，因為這些標簽的表達載體是廣泛可用的。

一、Flag 融合標簽的獨特結構
Flag 融合標簽由八個氨基酸（DYKDDDDK）組成，看似簡單卻蘊含著精妙的設計。其結構短小精悍，這一特點為后續的編碼和操作帶來極大便利。在這個八肽序列中，芳香族氨基酸發揮著關鍵作用，它們是抗原 - 抗體相互作用的主要參與者。序列中的第二個氨基酸 Tyr 尤為重要，其左側與帶負電的 Asp 相連，這種組合增強了 Tyr 的抗原性。而 Tyr 下游的六個氨基酸（Lys - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys）形成了高度親水的序列，該序列能夠塑造出高度暴露的三維蛋白質構型，從而展現出強大的抗原性。正是這種獨特的結構，使得 Flag 短肽能夠高效地發揮蛋白質標簽的功能。

二、Flag 融合標簽的顯著優勢

1.編碼簡易
僅由八個氨基酸構成的 Flag 序列，編碼時只需一條人工合成的寡核苷酸鏈即可完成。相比其他復雜的標簽，這種簡易的編碼方式大大降低了實驗成本和操作難度，提高了實驗效率，為科研人員節省了大量的時間和精力。

2.切割位點靈活
Flag 標簽含有腸激酶切割位點，腸激酶能夠精準識別短肽 C 端的五個氨基酸（DDDDK）。通過腸激酶處理，科研人員可以輕松除去標簽，獲得天然的非融合蛋白質，這對于需要研究蛋白質天然結構和功能的實驗至關重要，確保了實驗結果的準確性和可靠性。

3.融合位置多樣
Flag 抗原標簽的融合位置十分靈活，可以被融合到目的蛋白質的 N 端或 C 端。研究表明，融合在 N 端的 FLAG 序列穩定性良好，在大腸桿菌等表達系統中不會被蛋白酶輕易除去，并且在酵母和大腸桿菌中的表達性質相似。此外，當目的蛋白 N 端融合了 Flag 多肽后，C 末端還能繼續融合其他模塊或不同的親和配體，為蛋白質的多功能研究和應用提供了廣闊空間。

三、精準去除 Flag 標簽的方法
在蛋白研究過程中，有時需要去除 Flag 標簽以獲得純凈的目標蛋白。目前常用的標簽切除方法主要包括兩類：一是利用特異性蛋白酶進行酶切；二是在融合蛋白中引入蛋白內含肽系統。其中，蛋白酶切除法是應用最廣泛的方法，常用的蛋白酶包括：腸激酶（enterokinase）、凝血酶、Xa因子、煙草蝕紋病毒蛋白酶（TEV）、genenaseⅠ和3C蛋白酶等，這些蛋白酶都能在融合標簽與目的蛋白之間特定位點進行切割。

1. 腸激酶切除法：
腸激酶是去除N端Flag標簽最常用的蛋白酶，能精確識別D-D-D-D-K五肽序列。其切割效率主要取決于賴氨酸（K）后的第一個氨基酸殘基。Flag標簽（DYKDDDDK）本身就含有腸激酶識別位點，酶切后可獲得僅保留4個氨基酸殘基的短肽標簽。研究人員已成功克隆表達牛腸激酶催化亞基，該酶具有活性高、pH適應范圍廣等優點，且能在多種變性劑和去污劑條件下保持切割活性，切割產物不含多余氨基酸殘基。

Hosfield等采用不依賴連接的克隆技術（LIC），在Flag標簽與目的蛋白之間引入特定氨基酸殘基（X），構建了-DYKDDDDK-X-R序列（R代表目的蛋白）。以鈣調蛋白基因為模型，系統研究了X殘基對酶切效率的影響。實驗結果顯示：當X為Lys、Ala、Leu、Ile、Phe、Glu、Met、Asp或Asn時，切割效率可達80%以上；而當X為Tyr或Pro時，由于空間位阻效應，切割效率會降至70%以下。這一發現對獲得天然蛋白具有重要意義。因此，我們可以采用LIC技術將Flag標簽直接連接目的基因，表達純化后通過腸激酶切除標簽，從而獲得具有天然結構和功能的蛋白質。

2. 凝血酶切割
凝血酶也是一種應用廣泛的蛋白酶，不過它在切割重組蛋白后，會在切割位點的 C 端保留兩個氨基酸殘基。凝血酶可以識別兩種類型的氨基酸序列，對 X4 - X3 - P - P [K] - X1? - X2? 這種序列的識別效果更佳。在一些對蛋白質 C 端氨基酸序列要求不那么嚴格的實驗中，凝血酶可作為去除 Flag 標簽的選擇之一。

3. Xa 因子切割
Xa 因子是一種高效的去除融合標簽的工具酶，它能夠特異性識別 I - E [D] - G - R - X1 序列，并從融合標簽的 C 末端進行切除。在特定的實驗條件和蛋白質結構下，Xa 因子能夠發揮其高效切割的優勢，為科研人員提供了另一種去除 Flag 標簽的有效途徑。

Flag 融合標簽憑借其獨特的結構、顯著的優勢、多樣的抗體種類以及靈活的標簽去除方法，在蛋白純化與研究領域占據著重要地位。

產品信息


參考文獻
[1] Hopp T P ,   Prickett K S ,   Price V L , et al. A Short Polypeptide MarkerSequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification[J].Nature Biotechnology, 1988, 6(10):1204-1210.
[2] Gloeckner C J, Boldt K,SehumacherA,et al. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cellsby the Strep/FLAG (SF)-TAP tag[J]. Methods Mol Biol,2009,564, 359-372.
[3] Hopp T P ,   Woods K R . Prediction of protein antigenicdeterminants from amino acid sequences[J]. Proceedings of the National Academyof Sciences, 1981, 78(6):3824-3828.
[4] Babu M, Butland G, Pogoutse O, et al.Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolationand identification of protein complexes from Escherichia coli [J]. Methods MolBiol,2009,564: 373-400.

杭州斯達特 (www.starter-bio.com)志在為全球生命科學行業提供優質的抗體、蛋白、試劑盒等產品及研發服務。依托多個開發平臺：重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開發平臺（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）,已正式通過歐盟98/79/EC認證、ISO9001認證、ISO13485。