大腦具有驚人的分子多樣性，這種多樣性不僅是神經元復雜結構特化的基礎，也支撐著神經元間復雜的連接與突觸傳遞。要理解這些分子的功能，關鍵在于解析眾多蛋白的精確定位及其空間關系。然而，神經元精細結構內組分高度密集，傳統光學顯微鏡約200 nm的衍射極限阻礙了此類信息的獲取。

超分辨率成像技術突破了200 nm的傳統光學衍射極限，單分子定位技術（SMLM）具有20 nm的超高空間分辨率，是研究單個分子定位、蛋白相互作用等的理想工具，可以實現大分子復合物的原位可視化。該技術可應用于諸如突觸活動區的分子組織，生長錐和樹突棘中肌動蛋白的排列與膜運輸機制，單分子水平的突觸傳遞與可塑性，腦回路的納米級結構和軸突質膜下肌動蛋白和血影蛋白細胞骨架的顯著周期性等不同研究中。

Abbelight 3D單分子超分辨成像系統依托前沿的單分子定位顯微成像技術（SMLM），實現xyz三軸15 nm的超高分辨率，支持同時多色成像；該系統支持 STORM、PALM、PAINT 等單分子定位技術，并融入ASTER大視野成像、光譜拆分多色成像及Ultimate 3D成像技術，構建了一個強大易用的一體化平臺，助力神經科學家準確解析神經元細胞結構與功能的納米級分子機制。

3D單分子超分辨成像系統

 
本文將從納米級突觸表型檢測、膜相關周期性骨架和軸突起始段的結構組成三方面應用入手，介紹Abbelight 3D單分子超分辨成像系統在神經科學領域的應用。
 
納米級突觸表型檢測

圖1   突觸的多通道成像
橙色：囊泡GABA轉運蛋白；藍色：Bassoon管蛋白

 
不同突觸間神經遞質釋放的過程存在顯著差異，為探究這種差異是否與釋放過程中蛋白質的組織結構有關，J. Burrone 等^[1] 利用Abbelight 3D單分子超分辨成像系統，通過多色單分子定位技術對SypHy-RGECO（一種能同步檢測突觸前鈣離子內流與神經遞質釋放的雙重報告蛋白）進行成像，旨在研究單個突觸前小體的結構-功能關系。

通過 Cav2.1 和巴松管蛋白（Bassoon）與 SypHy-RGECO的雙色 dSTORM 超分辨成像，研究者發現這兩種活性區蛋白均以亞突觸結構域（SSDs）的形式存在。在代表單個突觸前小體的 SypHy-RGECO 團簇內，可包含 1 至 6 個 Cav2.1   SSD（均值=1.6，圖 2A）或 Bassoon SSDs（均值=1.7，圖 2B）。利用基于單分子檢測密度的分析軟件 Point Cloud Analyst 分析表明：含多個Cav2.1 SSDs的突觸，其SypHy 團簇體積更大（圖 2C）；含多個Bassoon SSDs的突觸，其SypHy 團簇體積差異更為顯著（圖 2D）。

這些結果表明，突觸可通過不同方式組織蛋白：既可形成單個SSD，也可構建具有不同密度的多個SSD。此類精細結構在傳統光學顯微鏡下無法觀測，凸顯了單分子定位技術在揭示突觸蛋白組織機制方面難以比擬的優勢，而 Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統憑借其超高分辨率，為觀測此類精細結構提供了有力支撐。

圖2   SypHy-RGECO團簇內的Cav2.1和Bassoon

 
J. Burrone等之后的一項研究^[2]表明，海馬CA1區基底樹突在起層（stratum oriens）形成的突觸中，約半數屬于多突觸小泡（MSB）—— 即單個突觸前小泡與來自不同細胞的多個（2-7個）突觸后棘形成興奮性連接。這類突觸數量龐大且具有特殊形態，此外單個MSB內部各突觸接觸點的特性差異，遠小于相鄰單突觸小泡（SSB）之間的異質性，這表明MSB通過其眾多接觸點傳遞相似的信息，暗示它們可能在促進神經網絡同步化活動中發揮作用。

研究人員使用STORM技術對標記了兩種突觸前分子 —— vGlut-1和Bassoon進行成像，分析多個樣本中MSB的分布情況（圖3）。結果顯示，vGlut-1呈現出突觸終端前小泡輪廓，而Bassoon染色則如預期呈現更明顯的點狀分布（圖3A、3B）。通過Abbelight Neo軟件的團簇分析功能發現，相較于SSB，MSB的vGlut團簇具有更大的體積（圖3C），但Bassoon團簇體積無顯著變化（圖3D）。更重要的是，MSB內部的Bassoon團簇體積離散度顯著低于不同SSB間的離散度（圖3E），這與MSBs活性區尺寸變異減小的測量結果一致。這些數據共同表明，MSBs通過各接觸點向多個細胞傳遞相似的信息，而 Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統的精準成像和配套分析軟件的強大功能，為該研究結論的得出提供了可靠依據。

圖3   多突觸小泡內部活性區的特性相似度顯著高于單突觸小泡

 
J. Burrone等的另一項研究^[3]發現，在發育中的海馬CA1神經元基底樹突上，興奮性和抑制性突觸的分布呈現高度相關性。這種緊密關聯在神經元發育早期（P7階段）最為顯著——此時抑制性突觸在分子和生理功能上均未成熟，而隨著興奮性突觸密度的增加，兩者的相關性會逐漸減弱。

研究人員發現，P7階段神經遞質釋放失敗率相較于更成熟的P21階段更高。為深入探究這一現象，研究人員使用dSTORM對vGAT標記的突觸前小泡進行超分辨率成像（圖4A），發現vGAT點狀團簇結構的體積在各階段均無顯著差異（圖4B），證實抑制性突觸在發育過程中未發生明顯變化。接下來對普遍存在于所有突觸小泡的活性區標志物Bassoon進行成像（圖4C）并用Abbelight Neo軟件進行共定位分析，發現在P7階段僅有約40%的內源性vGAT（白色）點狀團簇含有Bassoon（紅色）（圖4C行2）或另一關鍵活性區蛋白RIM1/2（紅色）（圖4C行3）。到P10階段時，絕大多數（約90%）vGAT陽性突觸已能清晰標記這兩種活性區標志物，且這種共定位在P21階段仍保持高度穩定（圖4C）。以上結果表明，在P7階段，基底樹突上的大多數抑制性突觸尚未成熟，其活性區未完全形成。Abbelight   3D 單分子超分辨成像系統的高分辨率成像能力和精準的共定位分析功能，使得這種突觸發育過程中的細微變化得以清晰呈現。

圖4   抑制性突觸早期發育時的組成變化

 
膜相關周期性骨架

C. Leterrier等^[4]通過多種單分子定位超分辨顯微技術，借助神經元培養體系中經驗證的微珠誘導突觸前膜模型，實現了對突觸前肌動蛋白的納米級結構解析和定量檢測，發現了一類主要的肌動蛋白富集型突觸前膜，存在三種特征性的肌動蛋白結構：活躍區域的肌動蛋白網狀結構（actin mesh）、連接活躍區與深層儲備池的肌動蛋白軌道狀結構（actin   rails），以及環繞整個突觸前區的肌動蛋白圍欄狀結構（actin corrals）。這類突觸不僅聚集了更多突觸前組分，其突觸小泡循環速率也顯著高于非富集型突觸。

為精確解析肌動蛋白與突觸前組分的空間關系，研究人員采用了三色STORM/PAINT聯用成像技術：先通過STORM對肌動蛋白成像，再運用雙色DNA-PAINT技術分別標記沿軸突干形成環狀結構的血影蛋白β2-spectrin和勾勒突觸小泡群的突觸素synapsin。結果證實血影蛋白膜下支架終止于突觸小泡處，而肌動蛋白圍欄結構包裹著突觸小泡團簇，其軌道狀結構指向活性區（圖5A）。通過STORM納米成像比較肌動蛋白富集型（A+）與非富集型（A-）誘導突觸前膜的差異顯示，A+與A-型誘導突觸前膜均含有三種肌動蛋白納米結構（網狀結構、軌道狀結構和圍欄狀結構）（圖5B）。進一步檢測包被微珠誘導的興奮性與抑制性突觸前膜是否均存在這三類肌動蛋白納米結構，通過抗VGLUT與VGAT抗體標記發現，兩類誘導突觸前膜的肌動蛋白納米結構無定性差異，絕大多數都含有網狀結構、軌道狀結構和圍欄狀結構（圖5E-F）。Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統支持多種成像模式，能夠精準解析復雜的分子空間關系，為研究膜相關周期性骨架提供了強大的技術支持。

圖5   各類誘導型突觸前膜中均存在肌動蛋白網狀結構、軌道狀結構與圍欄狀結構。

 
軸突起始段的結構組成

在哺乳動物的軸突性樹突（AcD）神經元中，軸突并非起源于胞體，而是從基底樹突發出，進而在軸突起始段（AIS）形成動作電位產生的特化通路。然而目前尚不明確這種特殊形態是如何建立的，以及AcD神經元中AIS的結構與功能是否得以保留。

K. Grünewald等^[5]采用離體海馬神經元培養模型，發現AcD形態的發育可發生在突觸形成之前，且不依賴于體內環境。單個前體神經突首先形成軸突，隨后發育為AcD。該AIS具有與胞體源AIS相似的細胞骨架結構，同樣作為運輸屏障維持軸突特異性分子組成。然而，它不經歷穩態可塑性，所含內質網池狀細胞器（cisternal organelles）更少，并且接收的抑制性輸入也較少。這些結果揭示了AcD神經元的獨特生物學特性，并表明了AIS結構特征可能因軸突起源不同而存在差異。

軸突起始段（AIS）的另一結構特征是包含膜相關周期性骨架（MPS）的膜下F-actin環以及胞內F-actin斑塊。研究人員為深入解析膜相關周期性骨架MPS的結構特征，在AcD神經元中進行了βIV-spectrin與F-actin的dSTORM成像，發現其軸突起始段（AIS）的βIV-血影蛋白同樣形成環狀結構，相鄰條帶間距約196 nm，且F-肌動蛋白與βIV-血影蛋白條帶呈互補分布模式（圖6），該結果與非AcD神經元的既往研究一致，表明AcD神經元中樹突起源的軸突并未改變其AIS區域的微管和MPS的納米結構。Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統的高分辨率和精準的成像能力，讓軸突起始段這種精細的結構組成得以清晰展示。

圖6   使用Abbelight光譜拆分技術實現軸突起始段的多通道成像

 
參考文獻：
[1] Jackson, R. E., Compans, B., &   Burrone, J. (2022). Correlative Live-Cell and Super-Resolution Imaging to   Link Presynaptic Molecular Organisation With Function. Frontiers in synaptic neuroScience, 14, 830583.
[2] Rigby, M., Grillo, F. W., Compans,   B., Neves, G., Gallinaro, J., Nashashibi, S., ... & Burrone, J. (2023).   Multi-synaptic boutons are a feature of CA1 hippocampal connections in the   stratum oriens. Cell Reports, 42(5).
[3] Horton, S., Mastrolia, V., Jackson,   R. E., Kemlo, S., Machado, P. M. P., Carbajal, M. A., ... & Burrone, J.   (2024). Excitatory and inhibitory synapses show a tight subcellular   correlation that weakens over development. Cell Reports, 43(7).
[4] Bingham, D., Jakobs, C. E., Wernert,   F., Boroni-Rueda, F., Jullien, N., Schentarra, E. M., ... & Leterrier, C.   (2023). Presynapses contain distinct actin nanostructures. Journal of Cell Biology, 222(10), e202208110.
[5] Han, Y., Hacker, D., Donders, B. C., Parperis, C., Thuenauer, R., Leterrier, C., ... & Mikhaylova, M. (2024).   Unveiling the cell biology of hippocampal neurons with dendritic axon origin. Journal of Cell Biology, 224(1), e202403141.