方案摘要：本方案采用雙抗體夾心法檢測登革病毒 NS1 抗原，適用于發病 5 天內患者血清的早期診斷。以抗 NS1 單克隆抗體包被酶標板，結合待檢血清中 NS1 抗原后，加入酶標記抗體形成復合物，經顯色反應判讀結果。操作中使用 PIpetty 電動移液器精準移取試劑，關鍵步驟包括包被、加樣、酶標反應、顯色及終止。結果以臨界值判定陰陽性，顯色強度與抗原含量正相關。該方法通過標準化操作提升檢測準確性，可快速為登革熱早期診斷、疫情監測提供依據，注意避免標本污染及與 Zika 病毒的交叉反應干擾。
  
方案詳情：
一、實驗原理
      在微孔條上預包被登革病毒的單克隆抗體，該抗體可與登革熱病例血清中的登革病毒中的NS1抗原特異性結合，再與辣根過氧化酶標記抗NS1抗體試劑進行第二次溫育，當樣品中存在登革病毒NS1抗原時將形成“包被抗體-NS1-酶標抗體”復合物。加入顯色劑，復合物上連接的辣根過氧化物酶催化顯示劑反應，生成藍色產物，終止反應后，變為黃色，若樣品中無登革病毒NS1抗原則不顯示。
 
二、? 實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭。
② 洗板機。
③ 酶標儀。
④ 恒溫溫箱。
⑤ 10mL吸管。
⑥ 稀釋血清用的試管。
⑦ 吸水紙。
 
2、試劑和材料
① 登革病毒NS1抗原酶聯免疫診斷試劑盒。
② 蒸餾水或去離子水。
 
三、實驗步驟
1、將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡 30min，使用前將試劑輕輕振蕩混勻；
2、配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水 20倍稀釋；
3、編號：將樣品對應微孔板編號，每板設陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔；
4、加稀釋液：使用Pipetty電動移液器，設置連續分液模式，每孔加稀釋液 50uL，空白孔除外；
5、加樣：更換新吸頭，使用連續分液模式分別在相應孔加入待測樣品或陰陽性對照各 50uL，空白孔除外；
 
6、溫育：用封板膜封板后，置 37℃溫育 60min；
7、每孔加酶標試劑 50uL，空白孔除外，輕輕振蕩混勻；
8、溫育：用封板膜封板后，置 37℃溫育 30min；
9、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后1次盡量扣干；
10、顯色：每孔加入顯色劑A、B液各 50uL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色 15min；
11、測定：每孔加終止液 50uL，10min 內測定結果。設定酶標儀波長于 450nm 處[建議使用雙波長 450nm/(600~650)nm 檢測]，用空白孔調零后測定各孔A值。
 
四、試驗結果
臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算）。
陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A≤0.1(若1孔A>0.1應舍棄，若兩孔或兩孔以上陰性對照>0.1，應重復實驗)。
陽性對照正常值范圍：A≥0.8。
陽性判定：樣品A值多臨界值者為登革病毒抗原陽性。
陰性判定：樣品A值<臨界值者為登革病毒抗原陰性。