Mechanosensitive microRNAs - Role in Endothelial Responses to Shear Stress and Redox State

Keywords: Endothelium, Shear Stress, miR, KLF2, Oxidative Stress, Inflammation
 

血管內皮細胞不僅是血液與血管壁的物理屏障，更通過抗凝、抗炎和抗氧化功能維持血管穩態。體內血流產生的切應力是調控內皮功能的關鍵因素：直段的脈動切應力（PS）誘導抗氧化與抗炎基因表達，而彎曲分叉處的振蕩切應力（OS）則促進促炎與氧化基因激活，這種差異導致動脈粥樣硬化的區域性分布，體外 PS 和 OS 模型可模擬這兩種血流模式。

微小 RNA（miR）通過形成沉默復合體降解靶 mRNA 或抑制翻譯，參與調控內皮細胞的血管生成、血管張力等核心功能。切應力可通過機械轉導通路調控 miR 及其宿主基因的轉錄，形成復雜的調控網絡 —— 例如，切應力誘導的 miR 可調控 KLF2、KLF4 等轉錄因子，而這些因子又能反向調節 miR 表達，且整個網絡受時間動態影響，需借助生物信息學工具解析。

基于此，加州大學里弗賽德分校醫學院生物醫學科學的研究團隊在Free radical biology & medicine期刊發表了題為“Mechanosensitive microRNAs - Role in Endothelial Responses to Shear Stress and Redox State”的文章。文章總結了剪切應力調控 miRs 在內皮穩態中的多維度作用，并探討了通過算法解析 PS 與OS 差異調控的信號網絡機制。
 

miR、KLF2 與功能性內皮細胞

miRNA 調控的關鍵步驟在于其基因或宿主基因的轉錄起始階段，而切應力誘導的轉錄因子（如 KLF2）可對大量 miRNA 的表達進行調控。作為內皮譜系的主要調節因子，KLF2 既能上調 eNOS、TM、Nrf2 等發揮抗炎、抗血栓和抗氧化作用的基因，又能抑制 VCAM-1、E - 選擇素、PAI-1 和組織因子等對內皮功能不利的基因表達。研究預測，KLF2 可轉錄調控 miR-126、miR-30a、miR-10a 等多個 miRNA。其中，miR-126 具有內皮特異性，可增強 VEGF 信號傳導，且在人類中，其轉錄起始位點上游 - 1 kb 處存在假定的 KLF2 結合位點，斑馬魚研究也證實 klf2a 可通過調控 miR-126 誘導血流刺激的血管生成。

在許多情況下，切應力誘導的轉錄因子本身在轉錄水平受到調控。抗動脈粥樣硬化的 PS 可激活 MEF5/ERK5/MEF2 和 AMPK 通路，共同促進 KLF2 的轉錄上調，同時 KLF2 還可通過 HDAC5 磷酸化增加，促使 HDAC 與 MEF2 解離，進而增強 MEF2 對 KLF2 的轉錄激活；而致動脈粥樣硬化的OS 則會通過上調 I 類和 II 類 HDAC 并使其核內積累，促進 MEF2 去乙酰化，從而降低 KLF2 的轉錄激活。重要的是，KLF2 也直接受 miRNAs 的靶向調控，如 OS 可升高內皮細胞中 miR-92a 的水平，其靶向 KLF2 和 KLF4 的 mRNA，導致 eNOS 等下游基因表達降低，進而引起致動脈粥樣硬化血流下的內皮功能紊亂，除已實驗驗證的 miR-92a 外，生物信息學分析還預測了多個 miRNA 可能靶向 KLF2 mRNA，對這些 miRNA 與血流條件的相關性及內皮細胞反應的研究具有重要意義。

微小 RNA（miR）生物學的進展表明，血流對 KLF2 的調控發生在多個層面，包括轉錄、轉錄后和翻譯后（圖 1）。因此，在研究 KLF2 在ECs對不同血流模式的響應及其與內皮細胞功能結局的關系時，應考慮包括 miR 在內的時間調控網絡，而非一系列信號事件的鏈式反應 。

圖 1 不同血流模式通過對KLF2和KLF4的多層次調控，決定了不同的內皮功能結局。

切應力、內皮細胞氧化還原狀態與miRs

致動脈粥樣硬化血流（如體內致動脈粥樣硬化模式和體外振蕩切應力 OS）可通過促進ECs中ROS的產生與積累，導致內皮功能紊亂并推動血管疾病進展。ECs 的氧化還原狀態由 NADPH 氧化酶（NOX）、eNOS、SOD 等多種酶介導，而miRs在此過程中起關鍵調控作用（圖 2）。OS 會上調靶向抗氧化基因的 miRs，下調靶向促氧化基因的 miRs，進而破壞氧化還原平衡；相反，抗動脈粥樣硬化血流（如體內保護模式和體外脈動切應力 PS）對 miR 網絡的調控作用與之相反，可維持氧化還原穩態。相關 miR 對 ECs 氧化還原及炎癥狀態的調控機制總結于表1。
 

圖 2 響應血流調節內皮細胞氧化還原狀態的潛在miR網絡示意圖。

表 1 剪切力誘導的miRs及其在內皮細胞氧化應激和炎癥中的作用。

NOX 激活是內皮細胞中 ROS 的主要來源，內皮細胞表達 NOX2 和 NOX4 兩種催化亞基，其激活依賴 p47phox 磷酸化及質膜易位結合 p67phox。研究發現 NOX 組分受微小 RNA（miRs）調控，如 NOX4 是 miR-25 的已驗證靶點、可能受 miR-23b 靶向，PS誘導的 miR-23b 或通過下調 NOX4 增強血管抗氧化能力；NOX2 亞基 p47phox 可能被 miR-17-5p 等 miRs 靶向，表明剪切應力可通過調控 miRs 靶向多個 NOX 亞基，精細調節 ROS 生成。

SOD 等抗氧化酶通過轉化 ROS 維持氧化還原平衡，致動脈粥樣硬化流可能通過上調 miRs 抑制抗氧化基因表達。miRs 網絡在 PS 與 OS 中呈現復雜調控：miR-21 在 PS 下關聯 eNOS 活性發揮保護作用，在 OS 下因靶向 SOD3 等促氧化；miR-30b 可抑制過氧化氫酶，PS 下調的 miR-17 * 靶向多種抗氧化酶基因，OS 或通過 miR-872 下調 SOD1。此外，硫氧還蛋白（Trx）及其相互作用蛋白（Trxnip）可能受剪切應力響應性 miRs 調控，如 miR-17 等靶向 Txnip 具保護作用，Trx 的 miRs 調控機制尚待明確，需進一步研究其對內皮的影響。

內皮型 eNOS 來源的 NO 與 ROS 的平衡是維持內皮功能的關鍵，NO 生物利用度降低會損害內皮功能。剪切應力通過 miRs 多維度調控 eNOS：PS 誘導的 KLF2 降低靶向 eNOS 的 miR-214，miR-221/222 和 miR-92a 通過靶向 ITGA5 及 KLF2 間接抑制 eNOS；翻譯后水平上，PS 通過 AMPK 磷酸化與 SIRT1 去乙酰化協同激活 eNOS，而 OS 下 miR-217 和 miR-33 可削弱該過程。此外，miR-148a 通過抑制促動脈粥樣硬化的 ROCK1 增加 eNOS 活性，揭示剪切應力通過 miRNA 網絡對 eNOS-NO 通路的多維度調控機制。

剪切應力對內皮細胞炎癥狀態及 miRs 的調控

內皮細胞的低炎癥應激狀態是其功能正常的標志之一，而剪切應力通過調控 miRs 影響內皮炎癥狀態：PS 通過下調促炎分子、上調抗炎 miRs（如 miR-10a、miR-30b、miR-181b）發揮抗炎作用（圖 3） 。這些 miRs 可通過靶向 MAP3K7、βTRC、importin-33 等分子抑制 NF-κB 通路激活，進而減少 IL-6、VCAM-1 等炎癥因子和黏附分子的表達，阻止單核細胞募集；相反，致動脈粥樣硬化血流會通過上調促炎分子、下調抗炎分子誘導內皮促炎狀態。該機制揭示了剪切應力通過 miR-NF-κB 通路調控內皮炎癥反應的關鍵作用，為動脈粥樣硬化等炎癥相關心血管疾病的防治提供了新視角。

圖 3 調控促炎 NF-κB 通路的假定 miR 網絡。

AngⅡ 是 NF-κB 通路的強效激活劑，而 PS 可通過上調 miR-155 靶向 AngⅡ 受體 1、上調 miR-143/145 靶向血管緊張素轉換酶（ACE）以降低 AngⅡ 水平，從而抑制該通路激活來減輕內皮炎癥。KLF2對功能性內皮至關重要，其誘導的 miR-23b 可通過靶向 MAPK 結合蛋白 2 和 3 及 IκB 激酶 -α（IKKB-α）來抑制 NF-κB 和 MAPK8/JNK 通路激活，誘導的 miR-126 能抑制 VCAM-1 及 NF-κB，且 KLF2 誘導的 miR-143/145 可靶向 FRA-1 以抑制 miR-21 轉錄，進而避免 miR-21 靶向 PPARα 和 PPARγ 而維持 PPARα 對 NF-κB 和 AP-1 通路的抑制作用來負調控促炎基因表達。此外，OS 上調的 miR-663 雖不直接結合 KLF4 mRNA，但敲低 miR-663 可增加 KLF4 轉錄并減少 VCAM-1 和 E - 選擇素轉錄，而 KLF4 對增強內皮功能起積極作用，故影響 KLF4 上游信號或轉錄激活的 miRNA 可能對內皮功能產生不利影響。

miRs 在剪切應力調控內皮細胞周期、細胞骨架及間隙連接中的作用

與不同血流模式相關的內皮細胞特異性表型包括增殖或靜止等，抗動脈粥樣硬化血流下的內皮細胞增殖能力低，其靜止狀態通過阻止細胞進入 S 期維持，而剪切應力誘導的 KLF2 對該靜止狀態至關重要。這可能與 KLF2 調控 miR-23b 有關，PS 敏感的 miR-23b 與 Rb 蛋白 E2F1 低磷酸化相關，可增強低磷酸化 Rb 與 E2F1 的抑制性結合以阻滯細胞周期進程，不過 miR-23b 抑制 Rb 磷酸化的機制有待研究。

剪切應力通過影響連接蛋白和 VE-cadherin 等細胞間連接蛋白調節內皮通透性和完整性。紊亂血流可上調內皮細胞中 Cx43，以 PS 為主的動脈區域內皮邊界 VE-Cad 表達上調，雖然缺乏剪切應力通過 miRs 調控連接蛋白的直接數據，但連接蛋白和 VE-cadherin 可被 miRs 靶向，故其可能參與剪切應力對內皮通透性的調控。

不同血流模式會使內皮細胞形態不同，OS 或紊亂血流誘導的內皮細胞呈圓形且肌動蛋白絲隨機短分布，暴露于 PS 的內皮細胞則伸長并沿血流方向排列，肌動蛋白應力纖維有序平行，剪切應力響應性 miR-155 可能通過降低 RhoA 表達介導血流對內皮細胞骨架組織的影響，而 PAK 表達可被低剪切應力上調，因 miR-126 在斑馬魚中通過抑制 PAK1 調節血管完整性，故推測致動脈粥樣硬化血流可能通過抑制 KLF2 誘導的 miR-126 來上調 PAK。

內皮細胞中剪切應力調控 miRs 的未來研究方向

當前對剪切應力調控 miR 及 miR 調控內皮細胞功能的研究，多基于單個或少數時間點的線性分析，而內皮細胞中 miR 調控網絡因機械傳感器和信號級聯的時空參與、多 miR 靶向共同 mRNA、多轉錄因子調控 miR 基因以及 miR 協同調控細胞表型等因素變得復雜，故未來研究需引入時間分辨率和系統分析方法，以闡明事件間的因果關系。

由于內皮細胞的機械轉導反應具有整合性和動態性，涉及多步驟的信號及基因表達調控網絡時，需通過時間和因果分析來捕捉代表性組件關系（圖 4）。為研究內皮細胞中動態的機械轉導網絡，可借助 PTMScout 等預測程序推導 PTM 參與的 miR 調控通路，并通過蛋白質組學和基因操作實驗驗證；利用 TRANSFAC?、JASPAR 等數據庫及 ChIP-seq 技術，可確定轉錄因子與 miR 啟動子的結合位置；通過 WormBase WS159 獲取 3'UTR 序列并結合 PIcTar 等程序可預測 miR 靶標，而 FIRM 算法和 KeyMolnet 模型則能進一步分析 miR 對 mRNA 的直接或間接調控及分子互作網絡，為揭示 miR 介導的血流表型機制提供工具。

鑒于內皮細胞表型是機械敏感信號和基因表達事件隨時間累積的結果，需借助時間依賴性數據集構建具有時間相關性的 miRNA 網絡，而基于分子實驗的計算機建模可提升細胞和器官水平功能驗證的可靠性。

圖 4 推導miR調控網絡及信號通路的網絡示意圖。

總之，體內剪切應力通過機械轉導高度調控內皮功能，影響其氧化還原與炎癥狀態。miRs在內皮細胞響應剪切應力中起關鍵作用：PS 誘導的 miRs 可抑制氧化應激與炎癥，維持血管穩態；OS 則激活相反的 miR 網絡。

參考文獻：Marin T, Gongol B, Chen Z, Woo B, Subramaniam S, Chien S, Shyy JY. Mechanosensitive microRNAs-role in endothelial responses to shear stress and redox state. Free Radic Biol Med. 2013 Sep;64:61-8. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2013.05.034. Epub 2013 May 30. PMID: 23727269; PMCID: PMC3762952.

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3762952/

Impact Factor: 7.1

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