從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測器和測量技術（下）_abio生物試劑品牌網
從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測器和測量技術（下）
本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測器。
“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對單點進行激發和測量的技術。本文旨在為用戶提供不同技術之間清晰的概覽，并針對不同應用場景給出合適的檢測器選擇建議，而非深入探討專業細節。
雪崩光電二極管
當然，目前也已經利用半導體技術制造出了可用于測量光強的光敏元件。其中，最容易與光電倍增管進行比較的器件是雪崩光電二極管（APD）。
將光子轉化為電荷對
利用半導體測量光強時，使用的是內光電效應。該效應是指光子被吸收后，在弱摻雜的半導體材料中產生一對電荷（自由電子和可擴散的“空穴”）。吸收層嵌入在p型和n型摻雜層之間，其作用類似于擴大了直接pn結處形成的耗盡區。該層被稱為“i”層，因為它只表現出本征導電性。由于各層的排列順序，這些半導體系統被稱為PIn二極管。如果在此類光電二極管的電極上施加反向偏置電壓，則會產生與入射光強度在很大范圍內成正比的電流。然而，這種二極管對于弱信號的靈敏度不夠高，且噪聲較大。
圖13：在雪崩光電二極管中，本征（i）層夾在外部的p型和n型摻雜層之間。光子在此處被吸收并觸發電荷對的產生。為簡單起見，此處僅圖示了一個電荷。施加的電場將該電荷移動到倍增區（右側的pn結）。在此處，會產生大量新的電荷對，從而可以在輸出端測量到一個脈沖。
雪崩效應
為了能夠測量更微弱的信號，在pin結構中增加了一個額外的層：在i層和n層之間插入另一個高摻雜的p層。此處形成的極高電場強度使電荷迅速加速，并在撞擊晶格原子時釋放能量，從而產生更多的電荷（這也是將其與PMT進行比較的原因）。這些新產生的電荷也會被加速，使這一過程像雪崩一樣迅速擴展，并在測量電路中產生一個脈沖。如果產生的電荷量適中，雪崩過程會自動停止，增益可達102。在極高的反向電壓下，可以獲得極高的增益（高達10?），但為了避免器件損壞，必須主動中斷電流。后一種情況被稱為“蓋革模式”，因為它適用于無需額外放大即可檢測單個光子。蓋革模式的缺點是在一次測量事件后存在較長的死區時間。因此，通常這種模式不適合用于圖像記錄。
它與光電倍增管（PMT）的不同之處
與光電倍增管不同，雪崩光電二極管的動態范圍較小，因此需要始終注意被測光的強度不宜過高。在非蓋革模式下，其增益在100倍到1000倍之間，具體取決于施加的電壓。另一方面，這種類型的檢測器具有極低的暗電流，使其非常適合檢測微弱信號，否則這些信號在高暗電流的背景噪聲中會被淹沒。其光譜靈敏度覆蓋了從300納米到超過1000納米的寬廣范圍，這也解釋了為什么APD也常用于特別是紅色熒光發射的圖像記錄。盡管在紅色波段具有極高的靈敏度，但其熱噪聲仍然相對較小。這種噪聲取決于檢測器的表面積，APD的表面積最大為0.1平方毫米，而PMT檢測器的表面積可達10平方毫米。
APD產生非常窄的脈沖，這是光子計數的一個重要特性。然而，這一特性只能在非蓋革模式下利用，因為在蓋革模式下，由于極長的死區時間（幾十納秒），這一優勢會喪失。
混合探測器
如果能夠將PMT的高動態范圍與APD的速度和低噪聲結合起來，那將是非常理想的。而混合探測器（HyD；也稱為HPD：混合光電探測器或HPMT：混合光電倍增管）正是通過結合真空管和半導體組件的嵌合技術實現了這一點。 該組件中兩種技術的結合確實產生了一種兼具PMT和APD最佳特性的檢測器。
設計
HyD的“輸入”部分與PMT完全相同：真空管中的光電陰極通過吸收光子釋放光電子。通常使用GaAsP光電陰極——這也是生物醫學熒光應用中使用的PMT最合適的陰極類型。然而，與PMT不同的是，HyD中的光電子不是分階段加速的，而是在一個單一步驟中經過超過8000伏特的電位差進行大幅加速。
由此可見，相對脈沖高度的差異遠小于PMT，后者到第一倍增極的加速電壓約為100伏。正如“光電倍增管”一章所述，第一倍增極釋放的電子數量在2到4個之間，預期方差為1到2個電子。這就是為什么PMT的脈沖高度通常變化3到5倍的原因。相比之下，混合探測器中的光電子被8千伏的電壓加速，從動能轉換中獲得約1500個次級電子。因此，變化約為40個電子（√1500）。雖然這肯定比2到4個電子要多，但僅占1500的3%。因此，輸出脈沖非常均勻，能夠更準確地反映激發能量。
圖14：混合探測器（HyD）的設計。與光電倍增管類似，光子（hν）在光電陰極處被吸收并產生一個自由電子（e–）。該電子在真空中以極高的電壓（約8千伏）加速。其能量在半導體材料中轉換為電荷對，并在倍增層（pn）中再次放大。
圖14：混合探測器（HyD）的設計。與光電倍增管類似，光子（hν）在光電陰極處被吸收并產生一個自由電子（e–）。該電子在真空中以極高的電壓（約8千伏）加速。其能量在半導體材料中轉換為電荷對，并在倍增層（pn）中再次放大。
使用 HyD 進行數據記錄
由于單步加速和隨后的直接放大，電荷的軌跡變化要小得多，這意味著HyD產生的脈沖比PMT產生的脈沖更加銳利：脈沖寬度減少了約20倍，約為1納秒（目前已接近?納秒）。
此外，由于沒有倍增極以及光電陰極的尺寸小得多，暗事件也大大減少。與光電倍增管相比，背景噪聲也顯著降低。除了提高記錄圖像的對比度之外，這還允許對更多圖像進行平均或累積。由于背景幾乎完全是黑色的，因此當大量圖像合并成一個圖像時，背景仍然保持黑色，這使得在高對比度下顯著降低信號噪聲成為可能。 因此，混合探測器具有諸多優勢。其均勻且窄的脈沖允許在光電流強度下進行光子計數，而這種光電流強度很快就會使PMT過飽和。
因此，即使是對于“普通”的圖像記錄，也應該考慮使用處于光子計數模式的混合探測器。畢竟，正如“光子計數”一章所述，與模擬檢測技術相比，光子計數具有許多優勢。
圖15：與圖7、10和11中描述的事件過程相同，但此處使用的是混合探測器，相比普通PMT，它具有更高的帶寬和更恒定的脈沖高度。顯著提高的脈沖分辨率使得能夠分辨間隔更緊密的脈沖（即在光子計數模式下可以記錄更高的光強度）。此外，也不會遺漏小的脈沖。
因此，評估結果不會產生被噪聲“污損”的直方圖和準連續的直方圖，而是如預期的那樣，產生定義清晰的、僅包含少量光子的頻率分布。圖9展示的就是這樣一種直方圖。頂部顯示的是每個像素平均10個光子的泊松分布。
利用混合探測器，徠卡TCS SP8系統提供了三種不同的數據記錄技術供用戶自由選擇。首先，可以將光子計數的原始數據直接用作圖像信息（“光子計數”模式）。由于該模式不使用線性化方法，因此最大計數率低于線性化數據，但仍然顯著高于傳統光電倍增管。獲得的速率約為60 Mcps（兆計數/秒）（詳見“光子計數”章節）。
如果通過上述的數學線性化方法對計數事件進行校正，最大計數率將提高5倍，可以記錄高達300 Mcps的亮度。在這種情況下，光子可以轉換為不一定是整數的值，因此最好立即進行縮放處理，以使亮度值與傳統檢測器具有可比性，并適合在顯示器上進行平衡顯示。該方法是標準應用的方法。請注意，由于展寬和舍入效應，直方圖可能看起來“奇怪”。但是，在評估圖像亮度時測量的數據仍然是正確的。
為了更好地呈現所使用的總動態范圍，還可以對數值進行調整，以減少明亮像素的影響并增加黑暗像素的影響。這類似于HDR渲染的效果。這種模式被稱為“Bright R”，用于顯示亮度差異很大的圖像，以避免明亮區域出現眩光，并使黑暗區域保持可見。例如，細胞體中含有大量染料而樹突非常細的神經元就屬于這種情況。
參考文獻：
[1] Becquerel AE: Mémoire sur les effets électriques produits sous l’influence des rayons solAIres. Comptes Rendus 9: 561–67 (1839).
[2] Hertz HR: Ueber den Einfluss des ultravioletten Lichtes auf die electrische Entladung. Annalen der Physik 267 (8): 983–1000 (1887).
[3] Hallwachs WLF: Ueber die Electrisierung von Metallplatten durch Bestrahlung mit electrischem Licht. Annalen der Physik 34: 731–34 (1888).
[4] Einstein A: Ueber einen die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt. Annalen der Physik 322 (6): 132–48 (1905).
[5] Newton I: Opticks. Or, A Treatise of the Reflections, Refractions, Inflections and Colours of Light (1704).
[6] Planck M: Ueber irreversible Strahlungsvorg?nge. Ann. Phys, 1: 69–122 (1900).
[7] Hamamatsu Photonics KK: Photomultiplier Tubes – Basics and Applications. Ed. 3a: 310 (2007).
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雪崩光電二極管
當然，目前也已經利用半導體技術制造出了可用于測量光強的光敏元件。其中，最容易與光電倍增管進行比較的器件是雪崩光電二極管（APD）。
將光子轉化為電荷對
利用半導體測量光強時，使用的是內光電效應。該效應是指光子被吸收后，在弱摻雜的半導體材料中產生一對電荷（自由電子和可擴散的“空穴”）。吸收層嵌入在p型和n型摻雜層之間，其作用類似于擴大了直接pn結處形成的耗盡區。該層被稱為“i”層，因為它只表現出本征導電性。由于各層的排列順序，這些半導體系統被稱為PIn二極管。如果在此類光電二極管的電極上施加反向偏置電壓，則會產生與入射光強度在很大范圍內成正比的電流。然而，這種二極管對于弱信號的靈敏度不夠高，且噪聲較大。
圖13：在雪崩光電二極管中，本征（i）層夾在外部的p型和n型摻雜層之間。光子在此處被吸收并觸發電荷對的產生。為簡單起見，此處僅圖示了一個電荷。施加的電場將該電荷移動到倍增區（右側的pn結）。在此處，會產生大量新的電荷對，從而可以在輸出端測量到一個脈沖。
雪崩效應
為了能夠測量更微弱的信號，在pin結構中增加了一個額外的層：在i層和n層之間插入另一個高摻雜的p層。此處形成的極高電場強度使電荷迅速加速，并在撞擊晶格原子時釋放能量，從而產生更多的電荷（這也是將其與PMT進行比較的原因）。這些新產生的電荷也會被加速，使這一過程像雪崩一樣迅速擴展，并在測量電路中產生一個脈沖。如果產生的電荷量適中，雪崩過程會自動停止，增益可達102。在極高的反向電壓下，可以獲得極高的增益（高達10?），但為了避免器件損壞，必須主動中斷電流。后一種情況被稱為“蓋革模式”，因為它適用于無需額外放大即可檢測單個光子。蓋革模式的缺點是在一次測量事件后存在較長的死區時間。因此，通常這種模式不適合用于圖像記錄。
它與光電倍增管（PMT）的不同之處
與光電倍增管不同，雪崩光電二極管的動態范圍較小，因此需要始終注意被測光的強度不宜過高。在非蓋革模式下，其增益在100倍到1000倍之間，具體取決于施加的電壓。另一方面，這種類型的檢測器具有極低的暗電流，使其非常適合檢測微弱信號，否則這些信號在高暗電流的背景噪聲中會被淹沒。其光譜靈敏度覆蓋了從300納米到超過1000納米的寬廣范圍，這也解釋了為什么APD也常用于特別是紅色熒光發射的圖像記錄。盡管在紅色波段具有極高的靈敏度，但其熱噪聲仍然相對較小。這種噪聲取決于檢測器的表面積，APD的表面積最大為0.1平方毫米，而PMT檢測器的表面積可達10平方毫米。
APD產生非常窄的脈沖，這是光子計數的一個重要特性。然而，這一特性只能在非蓋革模式下利用，因為在蓋革模式下，由于極長的死區時間（幾十納秒），這一優勢會喪失。
混合探測器
如果能夠將PMT的高動態范圍與APD的速度和低噪聲結合起來，那將是非常理想的。而混合探測器（HyD；也稱為HPD：混合光電探測器或HPMT：混合光電倍增管）正是通過結合真空管和半導體組件的嵌合技術實現了這一點。 該組件中兩種技術的結合確實產生了一種兼具PMT和APD最佳特性的檢測器。
設計
HyD的“輸入”部分與PMT完全相同：真空管中的光電陰極通過吸收光子釋放光電子。通常使用GaAsP光電陰極——這也是生物醫學熒光應用中使用的PMT最合適的陰極類型。然而，與PMT不同的是，HyD中的光電子不是分階段加速的，而是在一個單一步驟中經過超過8000伏特的電位差進行大幅加速。
由此可見，相對脈沖高度的差異遠小于PMT，后者到第一倍增極的加速電壓約為100伏。正如“光電倍增管”一章所述，第一倍增極釋放的電子數量在2到4個之間，預期方差為1到2個電子。這就是為什么PMT的脈沖高度通常變化3到5倍的原因。相比之下，混合探測器中的光電子被8千伏的電壓加速，從動能轉換中獲得約1500個次級電子。因此，變化約為40個電子（√1500）。雖然這肯定比2到4個電子要多，但僅占1500的3%。因此，輸出脈沖非常均勻，能夠更準確地反映激發能量。
圖14：混合探測器（HyD）的設計。與光電倍增管類似，光子（hν）在光電陰極處被吸收并產生一個自由電子（e–）。該電子在真空中以極高的電壓（約8千伏）加速。其能量在半導體材料中轉換為電荷對，并在倍增層（pn）中再次放大。
圖14：混合探測器（HyD）的設計。與光電倍增管類似，光子（hν）在光電陰極處被吸收并產生一個自由電子（e–）。該電子在真空中以極高的電壓（約8千伏）加速。其能量在半導體材料中轉換為電荷對，并在倍增層（pn）中再次放大。
使用 HyD 進行數據記錄
由于單步加速和隨后的直接放大，電荷的軌跡變化要小得多，這意味著HyD產生的脈沖比PMT產生的脈沖更加銳利：脈沖寬度減少了約20倍，約為1納秒（目前已接近?納秒）。
此外，由于沒有倍增極以及光電陰極的尺寸小得多，暗事件也大大減少。與光電倍增管相比，背景噪聲也顯著降低。除了提高記錄圖像的對比度之外，這還允許對更多圖像進行平均或累積。由于背景幾乎完全是黑色的，因此當大量圖像合并成一個圖像時，背景仍然保持黑色，這使得在高對比度下顯著降低信號噪聲成為可能。 因此，混合探測器具有諸多優勢。其均勻且窄的脈沖允許在光電流強度下進行光子計數，而這種光電流強度很快就會使PMT過飽和。
因此，即使是對于“普通”的圖像記錄，也應該考慮使用處于光子計數模式的混合探測器。畢竟，正如“光子計數”一章所述，與模擬檢測技術相比，光子計數具有許多優勢。
圖15：與圖7、10和11中描述的事件過程相同，但此處使用的是混合探測器，相比普通PMT，它具有更高的帶寬和更恒定的脈沖高度。顯著提高的脈沖分辨率使得能夠分辨間隔更緊密的脈沖（即在光子計數模式下可以記錄更高的光強度）。此外，也不會遺漏小的脈沖。
因此，評估結果不會產生被噪聲“污損”的直方圖和準連續的直方圖，而是如預期的那樣，產生定義清晰的、僅包含少量光子的頻率分布。圖9展示的就是這樣一種直方圖。頂部顯示的是每個像素平均10個光子的泊松分布。
利用混合探測器，徠卡TCS SP8系統提供了三種不同的數據記錄技術供用戶自由選擇。首先，可以將光子計數的原始數據直接用作圖像信息（“光子計數”模式）。由于該模式不使用線性化方法，因此最大計數率低于線性化數據，但仍然顯著高于傳統光電倍增管。獲得的速率約為60 Mcps（兆計數/秒）（詳見“光子計數”章節）。
如果通過上述的數學線性化方法對計數事件進行校正，最大計數率將提高5倍，可以記錄高達300 Mcps的亮度。在這種情況下，光子可以轉換為不一定是整數的值，因此最好立即進行縮放處理，以使亮度值與傳統檢測器具有可比性，并適合在顯示器上進行平衡顯示。該方法是標準應用的方法。請注意，由于展寬和舍入效應，直方圖可能看起來“奇怪”。但是，在評估圖像亮度時測量的數據仍然是正確的。
為了更好地呈現所使用的總動態范圍，還可以對數值進行調整，以減少明亮像素的影響并增加黑暗像素的影響。這類似于HDR渲染的效果。這種模式被稱為“Bright R”，用于顯示亮度差異很大的圖像，以避免明亮區域出現眩光，并使黑暗區域保持可見。例如，細胞體中含有大量染料而樹突非常細的神經元就屬于這種情況。
參考文獻：
[1] Becquerel AE: Mémoire sur les effets électriques produits sous l’influence des rayons solAIres. Comptes Rendus 9: 561–67 (1839).
[2] Hertz HR: Ueber den Einfluss des ultravioletten Lichtes auf die electrische Entladung. Annalen der Physik 267 (8): 983–1000 (1887).
[3] Hallwachs WLF: Ueber die Electrisierung von Metallplatten durch Bestrahlung mit electrischem Licht. Annalen der Physik 34: 731–34 (1888).
[4] Einstein A: Ueber einen die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt. Annalen der Physik 322 (6): 132–48 (1905).
[5] Newton I: Opticks. Or, A Treatise of the Reflections, Refractions, Inflections and Colours of Light (1704).
[6] Planck M: Ueber irreversible Strahlungsvorg?nge. Ann. Phys, 1: 69–122 (1900).
[7] Hamamatsu Photonics KK: Photomultiplier Tubes – Basics and Applications. Ed. 3a: 310 (2007).
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