技術突破：三光子活體成像技術實現1700μm亞細胞分辨率成像_abio生物試劑品牌網
該研究由Falko Fuhrmann、Felix C. Nebeling、Fabrizio Musacchio等學者共同完成，文章題為《Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution》，于2025年5月在線發表于《Communications Biology》。
重要發現
01三光子成像技術的搭建與優化
為了實現對mPFC的深層活體成像，研究團隊搭建了一套先進的三光子顯微鏡系統。該系統采用了可調諧激光（1300-1700nm），激光重復頻率穩定在2MHz，并配備了900-1900nm鍍膜光學元件，確保長波長激發光的有效傳輸。
關鍵的技術優化包括：
色散補償，通過棱鏡補償器減少飛秒激光在光路中的脈沖展寬，提升熒光激發效率，使1mm深度處的高亮度熒光信號更豐富，信噪比顯著提高；
物鏡選擇，對比多款物鏡后，選用了Olympus25x水浸物鏡（數值孔徑1.05，傳輸波長至1700nm），其在1mm深度的熒光強度和信噪比表現最優；
擴大探測光學元件尺寸，增加非彈道光子的收集角度（從8°增至14°），進一步提升信號質量。這些優化讓系統能穿透小鼠顱骨窗口，清晰成像mPFC的各個區域和層級。
02 深層組織成像的核心成果在神經元成像方面，研究團隊在清醒固定的小鼠中，利用1300nm波長激發表達GCaMP6s的興奮性神經元，在1400μm深度記錄到240多個神經元的鈣瞬變，平均振幅為4.95±4.14[%ΔF/F]，半寬為3.24±2.25秒，成功捕捉到深層神經元的活動動態。
對于星形膠質細胞，團隊通過表達GCaMP5g的小鼠模型，在1200μm深度觀察到其鈣活動，包括離散微域的自發鈣事件和胞體的鈣變化，且這些活動的振幅、持續時間和頻率與淺層星形膠質細胞相似，表明深層星形膠質細胞的基礎功能特性具有一致性。
在小膠質細胞研究中，使用1650nm波長激發紅色熒光標記的小膠質細胞，首次在1100μm深度量化其突起的運動性，發現其周轉率為58.9±2%，且連續兩天成像顯示運動特性穩定，證明該技術的低侵入性。
此外，研究還實現了樹突棘密度的長期追蹤：在1mm以下深度，連續一周記錄到樹突棘密度為0.41±0.07μm?1，為研究神經元結構可塑性提供了新工具。
創新與亮點
01突破傳統成像的深度瓶頸
傳統雙光子成像受限于光散射，在腦組織中的成像深度通常不足1mm，且難以實現亞細胞分辨率。而本研究的三光子成像技術通過采用1300-1700nm的長波長激光，顯著減少了光在深層組織中的散射和吸收，將成像深度提升至1700μm，是雙光子成像的1.5倍以上。這一突破讓科研人員得以探索mPFC等以往難以觸及的深層腦區，為理解全腦網絡連接打開了新窗口。
以往研究mPFC常依賴侵入性的GRIN透鏡或微棱鏡，這些方法會損傷腦組織且成像范圍有限。本技術通過顱骨窗口實現非侵入式成像，避免了對腦結構的破壞。更重要的是，它能在1mm以下深度對同一批樹突棘進行連續一周的追蹤，且小膠質細胞在連續成像后仍保持正常運動特性，熱休克蛋白檢測呈陰性，證明其對細胞的干擾極小，為長期觀察神經可塑性和疾病進展提供了可靠手段。
03 多細胞類型的亞細胞分辨率成像
該技術首次在深層組織中同時實現了神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的亞細胞分辨率成像。例如，能清晰觀察到1000μm深度樹突棘的形態（1-2μm大小），量化小膠質細胞突起的細微運動（5μm尺度），以及星形膠質細胞微域的鈣信號變化。這種多維度成像能力，讓科研人員能同時研究不同細胞類型在深層腦區的結構與功能關聯，為揭示神經網絡的協同作用提供了關鍵工具。
04 技術應用的廣泛價值
mPFC與工作記憶、決策、情緒調控等高級認知功能密切相關，其功能異常與精神分裂癥、自閉癥、阿爾茨海默病等多種疾病相關。三光子成像技術的出現，為這些疾病的機制研究提供了直接觀察mPFC細胞活動的手段。例如，可通過追蹤樹突棘密度變化了解精神疾病中的神經元結構異常，或通過小膠質細胞運動性變化監測神經炎癥程度，有望加速疾病標志物的發現和新藥研發。
總結與展望
本研究成功開發并應用三光子活體成像技術，在小鼠mPFC實現了1700μm深度的亞細胞分辨率成像，首次同時記錄了神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的結構與功能特性，突破了傳統成像技術的深度和侵入性限制。
展望未來，該技術將成為探索mPFC在認知功能（如工作記憶、情緒調控）中作用的核心工具，助力揭示阿爾茨海默病、精神分裂癥等疾病的發病機制。同時，其在深層組織成像中的優勢也有望擴展到其他器官研究，推動整個生物醫學成像領域的發展，為精準醫學和神經科學研究帶來革命性突破。
論文信息聲明：本文僅用作學術目的。
Fuhrmann F, Nebeling FC, Musacchio F, Mittag M, Poll S, Müller M, Ambrad Giovannetti E, MAIbach M, Schaffran B, Burnside E, Chan ICW, Lagurin AS, Reichenbach N, Kaushalya S, Fried H, Linden S, Petzold GC, Tavosanis G, Bradke F, Fuhrmann M. Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution. Commun Biol. 2025 May 23;8(1):795.
DOI:10.1038/s42003-025-08079-8.
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