酵母雙雜交技術(shù)的原理和優(yōu)勢(shì)_abio生物試劑品牌網(wǎng)
蛋白互作是驗(yàn)證基因或疾病作用機(jī)理不可或缺的一環(huán)，常用的檢測(cè)方法有：酵母雙雜、串聯(lián)親和純化、co-IP、FRET、熒光蛋白（螢光素酶）融合等。不同的檢測(cè)方法各有優(yōu)勢(shì)，本期將介紹酵母雙雜的原理和優(yōu)勢(shì)。
· 酵母雙雜的原理 ·
酵母作為一種真核生物，其基因的轉(zhuǎn)錄需要反式作用因子的參與。反式作用因子GAL4由DNA結(jié)合域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD)組成，完整的GAL4能結(jié)合至啟動(dòng)子上游順式作用元件并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致下游基因的表達(dá)。
在構(gòu)建機(jī)制上，可將已知蛋白與BD構(gòu)建為融合蛋白，將待測(cè)蛋白和AD構(gòu)建為融合蛋白，若已知蛋白與待測(cè)蛋白存在相互作用，則兩者相互結(jié)合，導(dǎo)致BD與AD在空間上的距離非常相近，發(fā)揮完整的反式作用因子功能，啟動(dòng)下游報(bào)告基因表達(dá)，可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)判斷蛋白的互作水平。
在實(shí)際應(yīng)用中，通常有大量商業(yè)化產(chǎn)品直接使用，如AH109菌株，其既不能產(chǎn)生GAL4，又是Trp和Leu缺陷型菌株，無(wú)法在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。當(dāng)兩種配套載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，完整的反式作用因子能夠激活酵母中基因表達(dá)，使得酵母可在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，達(dá)到篩選互作蛋白的功能。
基于AD/BD的核系統(tǒng)酵母雙雜交原理
· 優(yōu)勢(shì)和局限 ·酵母雙雜的優(yōu)勢(shì)在于，其實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易檢測(cè)；同時(shí)酵母生長(zhǎng)速度快，可通過(guò)高通量庫(kù)篩，快速獲得大量與已知蛋白有互作的潛在蛋白，在初步篩選中具有重要應(yīng)用。
但其劣勢(shì)在于，酵母雙雜的假陽(yáng)性較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果需多次重復(fù)，或用其他互作方法驗(yàn)證，且基于AD/BD的酵母雙雜僅能驗(yàn)證核內(nèi)蛋白的互作，對(duì)于定位于核外蛋白，膜蛋白，或蛋白互作后定位轉(zhuǎn)移的蛋白，檢測(cè)結(jié)果可信度不高。針對(duì)此類蛋白，科研人員開(kāi)發(fā)了基于分離半泛素融合的膜系統(tǒng)酵母雙雜交。
本站“ABIO生物試劑品牌網(wǎng)”圖片文字來(lái)自互聯(lián)網(wǎng)
如果有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系微信: nanhu9181 處理，感謝~
