AVATAR系統(tǒng)應(yīng)用：低氧條件下膠質(zhì)母細胞瘤代謝表型研究_abio生物試劑品牌網(wǎng)
《Nature Metabolism》近期發(fā)布的一項研究通過多模態(tài)技術(shù)整合，首次證實膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma, GB）代謝異質(zhì)性主要由細胞內(nèi)在因素驅(qū)動，挑戰(zhàn)了微環(huán)境主導(dǎo)的傳統(tǒng)認知。研究團隊通過整合13C標記葡萄糖輸注患者的質(zhì)譜成像、空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并結(jié)合體外低氧培養(yǎng)及異種移植模型，系統(tǒng)分析了糖酵解型（高糖酵解低TCA循環(huán)活性）、氧化型（低糖酵解高TCA循環(huán)活性）及混合型（雙低活性）三種代謝表型的決定因素。研究創(chuàng)新性地采用美國XCellbio公司開發(fā)的AVATAR低氧培養(yǎng)系統(tǒng)，對GB患者來源的神經(jīng)球進行為期160小時的0.5% O?濃度培養(yǎng)，以評估低氧微環(huán)境對代謝表型的影響。
AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)
實驗結(jié)果顯示，在AVATAR系統(tǒng)模擬的0.5% O?低氧條件下，即使經(jīng)過160小時培養(yǎng)，GB細胞的轉(zhuǎn)錄組和代謝特征仍保持穩(wěn)定，未檢測到適應(yīng)性代謝重編程。這一關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)證實了GB代謝亞型（如糖酵解型、氧化型）主要由細胞內(nèi)在因素決定，并具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。該研究不僅闡明了GB代謝異質(zhì)性的細胞自主性調(diào)控機制，凸顯了AVATAR系統(tǒng)在精確模擬腫瘤微環(huán)境和解析細胞固有代謝特征中的重要價值，為膠質(zhì)母細胞瘤的代謝研究提供了新的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
實驗方法
研究團隊對三名膠質(zhì)母細胞瘤患者在手術(shù)前靜脈輸注[U-13C]葡萄糖，隨后通過快速冷凍保存腫瘤組織樣本。質(zhì)譜成像（DESI-MSI和MALDI-MSI）用于分析腫瘤代謝活性，同時結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（10X Genomics Visium平臺）和成像質(zhì)譜流式技術(shù)（IMC）對腫瘤微環(huán)境進行表征。患者來源的神經(jīng)球在體外培養(yǎng)，并使用Matrigel基質(zhì)膠包埋形成球體，部分神經(jīng)球在低氧條件（0.5% O?）下培養(yǎng)，實驗中使用AVATAR（XCellbio）系統(tǒng)精確控制低氧環(huán)境。數(shù)據(jù)分析采用SCILS Lab、R和GraphPad Prism等軟件，并通過嚴格的統(tǒng)計方法確保結(jié)果的可信度。
實驗結(jié)果
1. 正常腦皮質(zhì)與膠質(zhì)母細胞瘤（GB）的代謝特征
通過質(zhì)譜成像（MSI）分析，膠質(zhì)母細胞瘤（GB）與正常腦組織在代謝特征上存在顯著差異。如圖1h所示，GB1中[U-13C]乳酸信號顯著低于GB2（P<0.0001），而[13C2]谷氨酸信號高于轉(zhuǎn)移瘤（P=0.0394），反映了轉(zhuǎn)移瘤中更高的糖酵解和更低的TCA循環(huán)活性。GB腫瘤中的谷氨酸標記與正常大腦中的標記相當(dāng)。這些結(jié)果揭示了GB腫瘤代謝的異質(zhì)性。
圖1.術(shù)中冷凍可迅速阻滯組織代謝并實現(xiàn)代謝活動的可視化
2. 代謝物13C標記揭示膠質(zhì)母細胞瘤代謝表型
研究團隊通過基于7種13C標記代謝物（糖酵解途徑和TCA循環(huán)）的k-means聚類分析，在膠質(zhì)母細胞瘤(GB)中鑒定出三種由腫瘤細胞自身決定的固有代謝表型：糖酵解型（狀態(tài)3：高糖酵解低TCA循環(huán)活性）、氧化型（狀態(tài)2：低糖酵解高TCA循環(huán)活性）以及混合型（狀態(tài)1：兩種途徑活性均低）。值得注意的是，雖然GB1以氧化表型（狀態(tài)2）為主，GB2以糖酵解表型（狀態(tài)3）為主，但兩種腫瘤內(nèi)部均同時存在這三種代謝區(qū)域（圖2b）。空間轉(zhuǎn)錄組分析進一步驗證了這些代謝表型，與MSI數(shù)據(jù)顯示出65%的一致性（圖2c）。這些結(jié)果表明GB腫瘤具有顯著的代謝異質(zhì)性，且不同代謝表型在空間上形成明確分界的大區(qū)域，這種分布模式可能為臨床代謝成像提供可行性基礎(chǔ)。
圖2.膠質(zhì)母細胞瘤（GB）組織切片中代謝表型的鑒定
3. 代謝表型與微環(huán)境無顯著相關(guān)性
實驗結(jié)果表明，膠質(zhì)母細胞瘤（GB）的代謝表型（糖酵解型、氧化型和混合型）與腫瘤微環(huán)境（TME）的特征無顯著相關(guān)性。通過質(zhì)譜成像（MSI）和空間轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，不同代謝表型區(qū)域的能量狀態(tài)（ATP/ADP、PCr/ATP比值）、氧化還原水平（AsA/DHA、GSH/GSSG、乳酸/丙酮酸比值）以及微環(huán)境特征（免疫細胞浸潤、增殖標志物Ki67表達、血管密度）均無顯著差異（圖2d、2e）。此外，壞死區(qū)域或與血管的距離也未影響代謝表型的分布。空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進一步證明，惡性細胞主導(dǎo)區(qū)域可同時存在三種代謝狀態(tài)，而免疫細胞富集區(qū)多呈糖酵解表型，神經(jīng)元區(qū)域則以氧化型為主（圖2g-i）。關(guān)鍵的是，低氧標志物CAIX表達及各類微環(huán)境細胞群在不同代謝區(qū)間無差異。這些證據(jù)共同表明，GB的代謝異質(zhì)性主要源于腫瘤細胞自身固有的代謝重編程，而非微環(huán)境因素驅(qū)動。
4. 代謝表型與血管分布無顯著關(guān)聯(lián)
通過篩選大血管（膠原蛋白I+與αSMA+標記），并將其與連續(xù)質(zhì)譜成像切片進行共定位，以65微米為間隔從血管腔向外測量13C標記的糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝物。結(jié)果顯示：無論距離血管遠近，乳酸和谷氨酸標記水平、Ki67+染色所示的增殖細胞數(shù)量、NADPH/NADP+比值（AsA:DHA比值）或NADH/NAD+比值（[U-13C]乳酸/[U-13C]丙酮酸比值）均無差異。然而，隨著與血管壁距離的增加，免疫細胞數(shù)量呈下降趨勢。這些數(shù)據(jù)表明，GB腫瘤細胞的代謝特征不受局部血管供應(yīng)的顯著影響，進一步支持了代謝表型的細胞固有性，而非由血管微環(huán)境驅(qū)動的結(jié)論。
5. 原代神經(jīng)球保留腫瘤代謝表型特征
實驗結(jié)果表明，膠質(zhì)母細胞瘤（GB）患者來源的原代神經(jīng)球在體外培養(yǎng)條件下仍能保留其體內(nèi)觀察到的三種代謝表型（糖酵解型、氧化型和混合型）。通過質(zhì)譜成像（MSI）分析顯示，神經(jīng)球的代謝特征與原始腫瘤組織高度一致，且不同代謝表型的神經(jīng)球在直徑大小、能量狀態(tài)（ATP/ADP比值）等方面無顯著差異（圖3a-e）。值得注意的是，來自同一腫瘤不同區(qū)域的神經(jīng)球（如GTP2 Med和GTP2 Lat）展現(xiàn)出與原始區(qū)域相匹配的代謝異質(zhì)性（圖3f,g）。此外，這些代謝表型在長期低氧（0.5% O?）培養(yǎng)條件下仍保持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄組分析未發(fā)現(xiàn)顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)證實了GB代謝表型的細胞固有性和可塑性，表明其獨立于腫瘤微環(huán)境的影響，為后續(xù)體外研究和藥物篩選提供了可靠模型。
圖3 .原代神經(jīng)球模型重現(xiàn)GB患者的代謝表型特征
6. 神經(jīng)球代謝表型在大鼠腦中得以重現(xiàn)
實驗結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的膠質(zhì)母細胞瘤（GB）神經(jīng)球代謝表型在異種移植到大鼠腦內(nèi)后仍能穩(wěn)定維持。通過質(zhì)譜成像（MSI）分析顯示，AT8和S2細胞形成的移植瘤表現(xiàn)出高糖酵解活性（[U-13C]乳酸標記水平升高），而AT5移植瘤則呈現(xiàn)高氧化代謝特征（[13C2]谷氨酸標記水平升高）（圖4a,b）。這些代謝特征與原始神經(jīng)球表型完全一致，且不受移植瘤中細胞增殖（Ki67）、凋亡（CC3）或血管化（CD31）程度的影響。值得注意的是，先前研究顯示對放療更敏感的S2細胞在移植后表現(xiàn)出比A11細胞更強的TCA循環(huán)活性（圖4c,d），進一步驗證了代謝表型與治療響應(yīng)的相關(guān)性。這些結(jié)果證實了GB代謝表型的細胞固有性在體內(nèi)外環(huán)境中的穩(wěn)定性，為基于代謝分型的個性化治療研究提供了重要依據(jù)。
圖4 . 原位移植的神經(jīng)球保持其代謝特征，且這些特征與藥物反應(yīng)相關(guān)
7. 代謝表型在其他通路中呈現(xiàn)特征性差異
患者腫瘤組織切片中，氧化性區(qū)域的未標記絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺及谷氨酸濃度顯著升高（ANOVA，Tukey檢驗P<0.05）；神經(jīng)球模型中，未標記亮氨酸/異亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸和苯丙氨酸濃度亦顯著增高（ANOVA，Tukey檢驗P<0.005）。這與既往研究中氧化型GB細胞依賴脂肪酸氧化的特征相符。這些發(fā)現(xiàn)揭示了代謝表型與多種代謝通路之間的廣泛關(guān)聯(lián)，為理解GB的代謝異質(zhì)性及其潛在治療靶點提供了新的分子層面的證據(jù)。
實驗結(jié)論
本研究通過高分辨率質(zhì)譜成像技術(shù)，在人體膠質(zhì)母細胞瘤（GB）中實現(xiàn)了細胞代謝物同位素標記的原位可視化分析，結(jié)合患者來源神經(jīng)球培養(yǎng)和原位移植瘤模型，系統(tǒng)證實了GB中存在三種由腫瘤細胞自身決定的固有代謝表型（糖酵解型、氧化型及混合型），這些表型基本獨立于腫瘤微環(huán)境（TME）的影響。
研究創(chuàng)新性地采用AVATAR低氧培養(yǎng)系統(tǒng)（0.5% O?）對患者來源神經(jīng)球進行長達160小時的持續(xù)低氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄組特征和代謝表型保持高度穩(wěn)定，這一關(guān)鍵實驗證據(jù)直接證實了GB代謝表型的細胞自主性及其對低氧微環(huán)境的抵抗能力。值得注意的是，與肺癌等腫瘤不同，GB細胞的TCA循環(huán)活性與正常腦組織相當(dāng)，且其代謝特征不受組織灌注差異的影響，其中氧化表型細胞對線粒體抑制劑和放療表現(xiàn)出顯著敏感性。基于超極化13C-MRI等先進代謝成像技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化潛力，本研究不僅為GB的分子分型提供了新的代謝標志物，更開創(chuàng)了個體化治療的新范式：如針對氧化型腫瘤采用放療聯(lián)合線粒體抑制劑。AVATAR系統(tǒng)的成功應(yīng)用，為在可控低氧條件下研究腫瘤細胞的固有代謝特性建立了標準化技術(shù)平臺，對深入理解腫瘤代謝異質(zhì)性具有重要方法論意義。
AVATAR個體化細胞控制系統(tǒng)
實驗結(jié)果顯示，在AVATAR系統(tǒng)模擬的0.5% O?低氧條件下，即使經(jīng)過160小時培養(yǎng)，GB細胞的轉(zhuǎn)錄組和代謝特征仍保持穩(wěn)定，未檢測到適應(yīng)性代謝重編程。這一關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)證實了GB代謝亞型（如糖酵解型、氧化型）主要由細胞內(nèi)在因素決定，并具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。該研究不僅闡明了GB代謝異質(zhì)性的細胞自主性調(diào)控機制，凸顯了AVATAR系統(tǒng)在精確模擬腫瘤微環(huán)境和解析細胞固有代謝特征中的重要價值，為膠質(zhì)母細胞瘤的代謝研究提供了新的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
實驗方法
研究團隊對三名膠質(zhì)母細胞瘤患者在手術(shù)前靜脈輸注[U-13C]葡萄糖，隨后通過快速冷凍保存腫瘤組織樣本。質(zhì)譜成像（DESI-MSI和MALDI-MSI）用于分析腫瘤代謝活性，同時結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（10X Genomics Visium平臺）和成像質(zhì)譜流式技術(shù)（IMC）對腫瘤微環(huán)境進行表征。患者來源的神經(jīng)球在體外培養(yǎng)，并使用Matrigel基質(zhì)膠包埋形成球體，部分神經(jīng)球在低氧條件（0.5% O?）下培養(yǎng)，實驗中使用AVATAR（XCellbio）系統(tǒng)精確控制低氧環(huán)境。數(shù)據(jù)分析采用SCILS Lab、R和GraphPad Prism等軟件，并通過嚴格的統(tǒng)計方法確保結(jié)果的可信度。
實驗結(jié)果
1. 正常腦皮質(zhì)與膠質(zhì)母細胞瘤（GB）的代謝特征
通過質(zhì)譜成像（MSI）分析，膠質(zhì)母細胞瘤（GB）與正常腦組織在代謝特征上存在顯著差異。如圖1h所示，GB1中[U-13C]乳酸信號顯著低于GB2（P<0.0001），而[13C2]谷氨酸信號高于轉(zhuǎn)移瘤（P=0.0394），反映了轉(zhuǎn)移瘤中更高的糖酵解和更低的TCA循環(huán)活性。GB腫瘤中的谷氨酸標記與正常大腦中的標記相當(dāng)。這些結(jié)果揭示了GB腫瘤代謝的異質(zhì)性。
圖1.術(shù)中冷凍可迅速阻滯組織代謝并實現(xiàn)代謝活動的可視化
2. 代謝物13C標記揭示膠質(zhì)母細胞瘤代謝表型
研究團隊通過基于7種13C標記代謝物（糖酵解途徑和TCA循環(huán)）的k-means聚類分析，在膠質(zhì)母細胞瘤(GB)中鑒定出三種由腫瘤細胞自身決定的固有代謝表型：糖酵解型（狀態(tài)3：高糖酵解低TCA循環(huán)活性）、氧化型（狀態(tài)2：低糖酵解高TCA循環(huán)活性）以及混合型（狀態(tài)1：兩種途徑活性均低）。值得注意的是，雖然GB1以氧化表型（狀態(tài)2）為主，GB2以糖酵解表型（狀態(tài)3）為主，但兩種腫瘤內(nèi)部均同時存在這三種代謝區(qū)域（圖2b）。空間轉(zhuǎn)錄組分析進一步驗證了這些代謝表型，與MSI數(shù)據(jù)顯示出65%的一致性（圖2c）。這些結(jié)果表明GB腫瘤具有顯著的代謝異質(zhì)性，且不同代謝表型在空間上形成明確分界的大區(qū)域，這種分布模式可能為臨床代謝成像提供可行性基礎(chǔ)。
圖2.膠質(zhì)母細胞瘤（GB）組織切片中代謝表型的鑒定
3. 代謝表型與微環(huán)境無顯著相關(guān)性
實驗結(jié)果表明，膠質(zhì)母細胞瘤（GB）的代謝表型（糖酵解型、氧化型和混合型）與腫瘤微環(huán)境（TME）的特征無顯著相關(guān)性。通過質(zhì)譜成像（MSI）和空間轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，不同代謝表型區(qū)域的能量狀態(tài)（ATP/ADP、PCr/ATP比值）、氧化還原水平（AsA/DHA、GSH/GSSG、乳酸/丙酮酸比值）以及微環(huán)境特征（免疫細胞浸潤、增殖標志物Ki67表達、血管密度）均無顯著差異（圖2d、2e）。此外，壞死區(qū)域或與血管的距離也未影響代謝表型的分布。空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進一步證明，惡性細胞主導(dǎo)區(qū)域可同時存在三種代謝狀態(tài)，而免疫細胞富集區(qū)多呈糖酵解表型，神經(jīng)元區(qū)域則以氧化型為主（圖2g-i）。關(guān)鍵的是，低氧標志物CAIX表達及各類微環(huán)境細胞群在不同代謝區(qū)間無差異。這些證據(jù)共同表明，GB的代謝異質(zhì)性主要源于腫瘤細胞自身固有的代謝重編程，而非微環(huán)境因素驅(qū)動。
4. 代謝表型與血管分布無顯著關(guān)聯(lián)
通過篩選大血管（膠原蛋白I+與αSMA+標記），并將其與連續(xù)質(zhì)譜成像切片進行共定位，以65微米為間隔從血管腔向外測量13C標記的糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝物。結(jié)果顯示：無論距離血管遠近，乳酸和谷氨酸標記水平、Ki67+染色所示的增殖細胞數(shù)量、NADPH/NADP+比值（AsA:DHA比值）或NADH/NAD+比值（[U-13C]乳酸/[U-13C]丙酮酸比值）均無差異。然而，隨著與血管壁距離的增加，免疫細胞數(shù)量呈下降趨勢。這些數(shù)據(jù)表明，GB腫瘤細胞的代謝特征不受局部血管供應(yīng)的顯著影響，進一步支持了代謝表型的細胞固有性，而非由血管微環(huán)境驅(qū)動的結(jié)論。
5. 原代神經(jīng)球保留腫瘤代謝表型特征
實驗結(jié)果表明，膠質(zhì)母細胞瘤（GB）患者來源的原代神經(jīng)球在體外培養(yǎng)條件下仍能保留其體內(nèi)觀察到的三種代謝表型（糖酵解型、氧化型和混合型）。通過質(zhì)譜成像（MSI）分析顯示，神經(jīng)球的代謝特征與原始腫瘤組織高度一致，且不同代謝表型的神經(jīng)球在直徑大小、能量狀態(tài)（ATP/ADP比值）等方面無顯著差異（圖3a-e）。值得注意的是，來自同一腫瘤不同區(qū)域的神經(jīng)球（如GTP2 Med和GTP2 Lat）展現(xiàn)出與原始區(qū)域相匹配的代謝異質(zhì)性（圖3f,g）。此外，這些代謝表型在長期低氧（0.5% O?）培養(yǎng)條件下仍保持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄組分析未發(fā)現(xiàn)顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)證實了GB代謝表型的細胞固有性和可塑性，表明其獨立于腫瘤微環(huán)境的影響，為后續(xù)體外研究和藥物篩選提供了可靠模型。
圖3 .原代神經(jīng)球模型重現(xiàn)GB患者的代謝表型特征
6. 神經(jīng)球代謝表型在大鼠腦中得以重現(xiàn)
實驗結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的膠質(zhì)母細胞瘤（GB）神經(jīng)球代謝表型在異種移植到大鼠腦內(nèi)后仍能穩(wěn)定維持。通過質(zhì)譜成像（MSI）分析顯示，AT8和S2細胞形成的移植瘤表現(xiàn)出高糖酵解活性（[U-13C]乳酸標記水平升高），而AT5移植瘤則呈現(xiàn)高氧化代謝特征（[13C2]谷氨酸標記水平升高）（圖4a,b）。這些代謝特征與原始神經(jīng)球表型完全一致，且不受移植瘤中細胞增殖（Ki67）、凋亡（CC3）或血管化（CD31）程度的影響。值得注意的是，先前研究顯示對放療更敏感的S2細胞在移植后表現(xiàn)出比A11細胞更強的TCA循環(huán)活性（圖4c,d），進一步驗證了代謝表型與治療響應(yīng)的相關(guān)性。這些結(jié)果證實了GB代謝表型的細胞固有性在體內(nèi)外環(huán)境中的穩(wěn)定性，為基于代謝分型的個性化治療研究提供了重要依據(jù)。
圖4 . 原位移植的神經(jīng)球保持其代謝特征，且這些特征與藥物反應(yīng)相關(guān)
7. 代謝表型在其他通路中呈現(xiàn)特征性差異
患者腫瘤組織切片中，氧化性區(qū)域的未標記絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺及谷氨酸濃度顯著升高（ANOVA，Tukey檢驗P<0.05）；神經(jīng)球模型中，未標記亮氨酸/異亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸和苯丙氨酸濃度亦顯著增高（ANOVA，Tukey檢驗P<0.005）。這與既往研究中氧化型GB細胞依賴脂肪酸氧化的特征相符。這些發(fā)現(xiàn)揭示了代謝表型與多種代謝通路之間的廣泛關(guān)聯(lián)，為理解GB的代謝異質(zhì)性及其潛在治療靶點提供了新的分子層面的證據(jù)。
實驗結(jié)論
本研究通過高分辨率質(zhì)譜成像技術(shù)，在人體膠質(zhì)母細胞瘤（GB）中實現(xiàn)了細胞代謝物同位素標記的原位可視化分析，結(jié)合患者來源神經(jīng)球培養(yǎng)和原位移植瘤模型，系統(tǒng)證實了GB中存在三種由腫瘤細胞自身決定的固有代謝表型（糖酵解型、氧化型及混合型），這些表型基本獨立于腫瘤微環(huán)境（TME）的影響。
研究創(chuàng)新性地采用AVATAR低氧培養(yǎng)系統(tǒng)（0.5% O?）對患者來源神經(jīng)球進行長達160小時的持續(xù)低氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄組特征和代謝表型保持高度穩(wěn)定，這一關(guān)鍵實驗證據(jù)直接證實了GB代謝表型的細胞自主性及其對低氧微環(huán)境的抵抗能力。值得注意的是，與肺癌等腫瘤不同，GB細胞的TCA循環(huán)活性與正常腦組織相當(dāng)，且其代謝特征不受組織灌注差異的影響，其中氧化表型細胞對線粒體抑制劑和放療表現(xiàn)出顯著敏感性。基于超極化13C-MRI等先進代謝成像技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化潛力，本研究不僅為GB的分子分型提供了新的代謝標志物，更開創(chuàng)了個體化治療的新范式：如針對氧化型腫瘤采用放療聯(lián)合線粒體抑制劑。AVATAR系統(tǒng)的成功應(yīng)用，為在可控低氧條件下研究腫瘤細胞的固有代謝特性建立了標準化技術(shù)平臺，對深入理解腫瘤代謝異質(zhì)性具有重要方法論意義。
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