WGBS及多組學研究揭示納米塑料暴露對藻類初級生產力的表觀調控機制_abio生物試劑品牌網
近日，中山大學（深圳校區）農業與生物技術學院劉賽博博士等為第一作者，中山大學農業與生物技術學院黃曉辰副教授、中國海洋大學jian zhao為共同通訊作者，在納米科學領域王牌期刊《ACS Nano》發表題為《Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics》研究論文。研究探討了納米塑料（Nanoplastics, NPs）在環境相關濃度下對藻類（algae）初級生產力（Primary Productivity）的長期作用影響。研究人員選擇三種不同電荷的聚苯乙烯納米塑料（nPS、nPS-NH?和nPS-COOH），以10 μg/L的環境相關濃度暴露于小球藻（Chlorella sp.）100天，通過表觀基因組學（WGBS）和轉錄組學（RNA-seq）整合分析揭示了藻類對納米塑料的表觀遺傳適應機制，為環境應激下的生物適應性研究提供新的方法和理論基礎。
標題：Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics（由環境相關濃度的納米塑料長期暴露引起的藻類初級生產力的全基因組分子適應）
時間：2024年10月19日
期刊：ACS Nano
影響因子：IF16/Q1
技術平臺：WGBS、RNA-seq
作者單位：中山大學深圳校區劉賽博、黃曉辰等
DOI：10.1021/acsnano.4c09709
本研究結果表明，藻類通過增加藻的數量（10.34–16.52%）、葉綠素a（Chl a）（11.28–17.65%）和碳固定酶活性（49.19–68.33%）適應了這三種類型的納米塑料（nPS、nPS-NH?和nPS-COOH），這一結果也通過自然水體培養實驗得到了進一步證實。在個體水平上，基于藻類葉綠體數量和生物體積的分析，只有nPS導致藻類分化為兩個異質亞群（54.92% vs 45.08%），而nPS-NH?和nPS-COOH并未引起藻類群體分化。通過整合表觀基因組學（WGBS）和轉錄組學（RNA-seq）揭示了藻類對納米塑料的分子適應機制。藻類在暴露于nPS、nPS-NH?和nPS-COOH時的平均甲基化率顯著升高。與nPS和nPS-NH?相比，暴露于nPS-COOH時通過差異甲基化區域（differentially methylated regions，DMRs）調控基因表達方向差異。本研究結果強調了評估納米塑料長期生態毒性的重要性，并為理解納米塑料對水生生態系統的影響提供有用信息。
圖形摘要
易小結
本研究以環境真實濃度的納米塑料長期暴露小球藻，整合易基因科技提供的WGBS＋RNA-seq技術，從群體、個體到分子層面揭示藻類通過啟動子/genebody DNA甲基化重塑與轉錄網絡重編程，實現了初級生產力提升并可跨代傳遞。
易基因提供的“甲基化-基因表達”多組學分析不僅助力闡明“長期低劑量暴露產生何種生物學效應”，更為環境風險預警、綠色農業、健康毒理評估提供可復制、可擴展的“表觀遺傳學”研究范式：覆蓋更多物種、更多不同脅迫場景的領先技術服務。
研究方法
（1）納米塑料表征：掃描電子顯微鏡（SEM）觀察納米塑料的形態和粒徑，X射線光電子能譜（XPS）分析納米塑料表面官能團，Zeta電位測定納米塑料在藻類培養基中的電荷特性。
（2）藻類培養與長期暴露實驗：小球藻（Chlorella sp.）暴露濃度為10μg/L，25°C，14/10 h光暗周期，光照強度100 μmol/m2/s。半連續培養模式，每120小時更換一次新鮮培養基，持續100天。
（3）生理指標測定：細胞計數儀（Countstar）測定細胞數量，干重法測定生物量，分光光度法測定葉綠素a，葉綠素熒光儀測定最大電子傳遞速率（rETRmax），酶活測定RuBisCo活性，DCFH-DA熒光探針測定ROS水平。
（4）單細胞水平分析：流式細胞術（Flow Cytometry）測定每個細胞葉綠體數量，熒光激活細胞分選（FACS）不同葉綠體表達水平亞群。
（5）表觀基因組學（WGBS）和轉錄組學（RNA-seq）：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析DNA甲基化變化，RNA-seq分析基因表達變化。
結果圖形
（1）長期NPs暴露提升藻類初級生產力
在長達100天的納米塑料（NPs）暴露實驗中，研究人員發現藻類的初級生產力得到顯著提升。藻類細胞數量在nPS、nPS-COOH和nPS-NH?暴露組分別增加了16.50%、13.03%和10.32%。葉綠素a（Chl a）含量增加了11.28%-17.65%。然而，藻類生物量僅nPS和nPS-COOH暴露組增加，nPS-NH?暴露組無顯著變化。藻類的最大相對電子傳遞速率（rETRmax）在nPS和nPS-COOH暴露組中有所增加，且nPS-COOH暴露組的增加幅度最大。藻類通過光合作用固定二氧化碳的能力也得到了增強，這體現在所有三種類型的NPs均提高了RuBisCo活性（49.19%–68.33%）。研究人員還在自然水體中進行了暴露實驗，結果表明，在經過100天的暴露后，nPS和nPS-COOH暴露組的藻類細胞數量、生物量和Chl a均有所增加，這與在超純水制備的培養基中的實驗結果一致。然而，nPS-NH?暴露組的Chl a增加并不顯著，這可能是由于nPS-NH?與自然水體中的有機物結合，減少了與藻類細胞的接觸。
圖1：藻類在長期適應納米塑料（NPs）后的初級生產力。
（A） 藻類在實驗室中適應NPs的實驗設計圖。
（B-G）藻類菌株在實驗室適應期間的（B）葉綠素a（Chl a）含量、（C）藻類細胞數量、（D）葉綠素a含量、（E）生物量、（F）生物體積、（G）最大相對電子傳遞速率（rETRmax）。
（H-J）藻類在適應三種NPs 100天后的（H）RuBisCo活性、（I）藻類細胞數量、（J）葉綠素a含量。（K） 藻類在自然水體培養系統中暴露于三種NPs（100天）后的生物量。
（2）藻類初級生產力的個體性狀分化
為了進一步揭示不同表面電荷的NPs對藻類初級生產力響應的差異，研究人員在個體水平上評估了藻類的葉綠體數量。結果顯示，藻類細胞的平均葉綠體數量并未受到長期NPs適應的影響。盡管在三種NPs暴露組之間葉綠體體積沒有顯著差異，但在nPS暴露組中，從均質藻類群體中出現了兩個具有低水平（P1）和高水平（P2）葉綠體表達的亞群。相比之下，nPS-COOH和nPS-NH?暴露組并未表現出顯著的分化現象。P1亞群（占總細胞數的54.92%）的平均信號強度顯著下降至對照組的67.65%，而P2亞群（占總細胞數的45.08%）則顯著增加至對照組的131.64%。研究人員使用流式細胞儀（FACS）從大量藻類懸浮液中分選出了P1和P2亞群，分選效率超過95%。觀察P1和P2亞群的細胞形態發現，P2的生物體積比P1高出1.41倍。這種在nPS暴露下出現的亞群分化現象可能歸因于藻類的異質性。長期暴露于NPs的藻類與NPs之間的相互作用可能會觸發可遺傳的表型多樣性和生理特征的分化。在長期NPs暴露后，觀察到藻類初級生產力在群體水平上有所提高，而在個體水平上則表現出明顯的性狀分化，這表明藻類基因組在適應NPs的過程中發生了改變。
圖2：藻類在長期適應納米塑料（NPs）后的個體水平性狀分化。
（A）藻類個體初級生產力檢測的示意圖。
（B-C）有無NPs處理的藻類細胞在個體水平上的分布情況。
（D）P1和P2的代表性圖像及生物體積分布統計。
（E）P1和P2中藻類細胞的生物體積。
（3）NPs長期適應后藻類的全基因組DNA甲基化變化
為全面理解藻類初級生產力的提升，研究人員利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術，在單堿基分辨率下分析了小球藻在長期暴露于三種NPs后的DNA甲基化圖譜，并觀察到基因組水平上的變化。在對照組和暴露組中，藻類的甲基化位點數量在10.62M-19.17M，亞硫酸鹽轉化率高于99%，表明原始數據的完整性和可靠性。從平均甲基化率結果來看，與對照組相比，暴露于nPS、nPS-COOH和nPS-NH?的藻類發生高甲基化。5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基化水平也呈現出類似的基因組特征。整體甲基化率從對照組的0.88%顯著上升至nPS、nPS-COOH和nPS-NH?暴露組的0.90%、0.89%和0.90%。更多的高甲基化差異甲基化區域（DMRs）導致甲基化水平增加。5mC主要分布在CG位點（對照組為0.83%，nPS為0.84%，nPS-COOH為0.83%，nPS-NH?為0.84%），其次是CHG和CHH位點。與先前的一項研究類似，無論NPs類型如何，CG位點的甲基化水平和覆蓋率均高于CHG和CHH。因此，與CHG和CHH相比，CG位點更適合用于分析在長期NPs暴露下基因組信息的適應性變化。鑒于相鄰的甲基化位點通常協同作用，基因表達的變化高度依賴于低甲基化和高甲基化DMRs的水平。
圖3：藻類在長期適應納米塑料（NPs）后的DNA甲基化變化。
（A）DNA甲基化和基因表達的示意圖。
（B）5mC在功能基因組區域的相對密度分布。
（C）藻類在有無NPs處理下的平均甲基化率。
（D）暴露于三種NPs后的差異甲基化區域（DMRs）的數量。
（E-G）CG、CHG和CHH的（E）平均甲基化率，（F）甲基化水平，（G）在對照組中的甲基化深度。
（4）藻類DMRs對NPs的適應性變化
研究人員進一步通過比較nPS、nPS-COOH和nPS-NH?組與對照組的CG位點檢測了DMRs。結果顯示， nPS暴露組有534個高甲基化DMRs和209個低甲基化DMRs，nPS-COOH暴露組有497個高甲基化DMRs和310個低甲基化DMRs，nPS-NH?暴露組有660個高甲基化DMRs和470個低甲基化DMRs。因此，在暴露于三種類型的NPs后，高甲基化DMRs的數量均多于低甲基化DMRs。研究人員利用高甲基化區域為每個基因組scaffold構建了甲基化圖譜。DMRs在基因組中的分布顯示出在每個暴露組的所有支架中均呈現出高甲基化趨勢。在DMRs的基因組位點（啟動子、外顯子、內含子、3'UTR和5'UTR）中，位于啟動子和外顯子區域的DMRs數量多于內含子區域。任何NPs處理均能誘導更多的高甲基化DMRs位于啟動子區域，而在內含子區域則較少。為了闡釋DMRs的功能，研究人員利用啟動子相關DMRs關聯基因（DMGs）進行了KEGG功能富集分析。分析結果表明，暴露于NPs后的高甲基化DMRs和低甲基化DMRs均富集在一系列生物代謝過程（如“光合作用”和“甘油脂代謝”）中，這可能與藻類在長期NPs暴露后初級生產力的提升有關。
圖4：差異甲基化區域（DMRs）的分布與功能。
（A）暴露于三種納米塑料（NPs）后，DMRs在基因組scaffold中的分布情況。
（B）DMRs在基因組位點（啟動子、外顯子、內含子、3'UTR和5'UTR）中的分布情況。
（C）在啟動子和genebody區域鑒定的DMRs的KEGG功能富集分析。
（5）藻類長期適應后的轉錄組變化
為將藻類初級生產力的全基因組變化與生理變化聯系起來，研究人員利用RNA-seq技術確定了藻類在長期暴露于三種NPs后的轉錄組變化。轉錄組結果顯示，nPS-COOH暴露組引起的差異表達基因（DEGs）數量顯著多于nPS和nPS-NH?暴露組。此外研究人員還對DEGs進行注釋，并進行基因集富集分析（GSEA）以研究轉錄組變化功能。一系列與氨基酸和肽鏈合成相關通路（如tRNA生物合成、核糖體和核糖體生物合成）被三種類型的NPs抑制，表明所有三種類型NPs都能干擾蛋白質合成。外泌體通路被所有三種NPs上調，這一過程有助于從衰老細胞中清除ROS、氧化脂質和其他有害代謝物，從而重新啟動藻類增殖。光合作用蛋白通路在nPS-NH?處理下顯著下調。這一結果與DMRs富集結果一致（圖4C），可能解釋了為什么在nPS-NH?處理后藻類生物量和生物體積沒有顯著變化（圖1E、F）。
（6）NPs長期適應后基因組變化與基因表達水平的關系
研究人員進一步分析了甲基化組和轉錄組的結果，以揭示藻類在長期NPs暴露下受到影響的分子機制。DMGs和DEGs的整合分析結果揭示了nPS-COOH的DEGs數量多于其他兩組，因此在nPS-COOH暴露組中鑒定出的候選基因最多（69個）。本研究通過啟動子相關DMRs關聯基因（PDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于一系列通路，如蛋白質代謝過程、蛋白水解和含氮有機化合物代謝過程。相比之下，通過genebody（基因體）相關DMRs關聯基因（GDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于催化活性的正向調控、分子功能和水解酶活性等通路。這一結果表明碳和氮的代謝受啟動子區域甲基化調控。這些通路的調控可能代表了藻類對長期NPs暴露的適應性響應，并進一步影響下游功能。基因表達與DNA甲基化之間的Pearson相關性分析結果表明，PDMGs在nPS和nPS-NH?暴露組中與DEGs呈負相關，在nPS-COOH暴露組中則呈正相關。而GDMGs在nPS和nPS-NH?暴露組中與DEGs呈正相關，但在nPS-COOH暴露下則呈負相關。先前研究已經表明，啟動子區域高甲基化和基因體區域的低甲基化會抑制目標基因表達，而啟動子區域低甲基化和基因體區域高甲基化則會促進目標基因表達。nPS和nPS-NH?暴露組中DMRs和DEGs的相關性與先前的研究結果一致，但nPS-COOH暴露組的相關性則與先前研究結果相反。DNA甲基化對轉錄調控的負調控方向表明，nPS-COOH可能會導致藻類基因轉錄沉默，而nPS和nPS-NH?則不會。這表明在長期暴露于不同電荷的NPs后，藻類在基因組水平上的適應策略存在差異。
圖5：長期NP適應后基因組變化與基因表達水平的整合分析結果。
(A) 下調的差異表達基因（DEGs）與啟動子相關高甲基化差異甲基化區域（DMRs）關聯基因（PDMGs）。
(B) 下調的DEGs與基因體相關低甲基化DMRs關聯基因（GDMGs）。
(C) 上調的DEGs與低甲基化PDMRs。
(D) 上調的DEGs與高甲基化GDMRs。
(E) 對于(A)和(C)中的候選基因進行GO功能富集分析；
(F) 對于(B)和(D)中的候選基因進行GO功能富集分析；
(G) 暴露于三種NPs后，每個基因的基因表達與DNA甲基化之間的Pearson相關性分析。
討論和啟示
與短期高濃度暴露相比，長期低濃度暴露更能反映納米塑料在環境中的真實影響。DNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾，可能通過調控基因表達幫助藻類適應納米塑料的長期暴露。納米塑料可能通過增強藻類初級生產力，影響水生生態系統的碳循環和能量傳遞。本研究結果提示，納米塑料的生態毒理學評估需要考慮長期低濃度暴露的影響。
WGBS和RNA-seq技術為揭示藻類對納米塑料的適應性機制提供了重要工具
WGBS：通過全基因組重亞硫酸鹽測序，研究揭示了藻類在納米塑料長期暴露下的DNA甲基化變化，為理解藻類的表觀遺傳適應機制提供重要數據。
RNA-seq：通過轉錄組測序研究分析藻類基因表達的變化，揭示納米塑料對藻類生理功能的影響。
整合分析：WGBS和RNA-seq技術的關聯分析，從基因組和轉錄組兩個層面全面解析藻類對納米塑料的適應性機制，為環境應激下的生物適應性研究提供了新的方法和理論基礎。
參考文獻：
Liu S, Huang X, Han J, Yao L, Li H, Xin G, Ho SH, Zhao J, Xing B. Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics. ACS Nano. 2024 Oct 19. doi: 10.1021/acsnano.4c09709.
標題：Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics（由環境相關濃度的納米塑料長期暴露引起的藻類初級生產力的全基因組分子適應）
時間：2024年10月19日
期刊：ACS Nano
影響因子：IF16/Q1
技術平臺：WGBS、RNA-seq
作者單位：中山大學深圳校區劉賽博、黃曉辰等
DOI：10.1021/acsnano.4c09709
本研究結果表明，藻類通過增加藻的數量（10.34–16.52%）、葉綠素a（Chl a）（11.28–17.65%）和碳固定酶活性（49.19–68.33%）適應了這三種類型的納米塑料（nPS、nPS-NH?和nPS-COOH），這一結果也通過自然水體培養實驗得到了進一步證實。在個體水平上，基于藻類葉綠體數量和生物體積的分析，只有nPS導致藻類分化為兩個異質亞群（54.92% vs 45.08%），而nPS-NH?和nPS-COOH并未引起藻類群體分化。通過整合表觀基因組學（WGBS）和轉錄組學（RNA-seq）揭示了藻類對納米塑料的分子適應機制。藻類在暴露于nPS、nPS-NH?和nPS-COOH時的平均甲基化率顯著升高。與nPS和nPS-NH?相比，暴露于nPS-COOH時通過差異甲基化區域（differentially methylated regions，DMRs）調控基因表達方向差異。本研究結果強調了評估納米塑料長期生態毒性的重要性，并為理解納米塑料對水生生態系統的影響提供有用信息。
圖形摘要
易小結
本研究以環境真實濃度的納米塑料長期暴露小球藻，整合易基因科技提供的WGBS＋RNA-seq技術，從群體、個體到分子層面揭示藻類通過啟動子/genebody DNA甲基化重塑與轉錄網絡重編程，實現了初級生產力提升并可跨代傳遞。
易基因提供的“甲基化-基因表達”多組學分析不僅助力闡明“長期低劑量暴露產生何種生物學效應”，更為環境風險預警、綠色農業、健康毒理評估提供可復制、可擴展的“表觀遺傳學”研究范式：覆蓋更多物種、更多不同脅迫場景的領先技術服務。
研究方法
（1）納米塑料表征：掃描電子顯微鏡（SEM）觀察納米塑料的形態和粒徑，X射線光電子能譜（XPS）分析納米塑料表面官能團，Zeta電位測定納米塑料在藻類培養基中的電荷特性。
（2）藻類培養與長期暴露實驗：小球藻（Chlorella sp.）暴露濃度為10μg/L，25°C，14/10 h光暗周期，光照強度100 μmol/m2/s。半連續培養模式，每120小時更換一次新鮮培養基，持續100天。
（3）生理指標測定：細胞計數儀（Countstar）測定細胞數量，干重法測定生物量，分光光度法測定葉綠素a，葉綠素熒光儀測定最大電子傳遞速率（rETRmax），酶活測定RuBisCo活性，DCFH-DA熒光探針測定ROS水平。
（4）單細胞水平分析：流式細胞術（Flow Cytometry）測定每個細胞葉綠體數量，熒光激活細胞分選（FACS）不同葉綠體表達水平亞群。
（5）表觀基因組學（WGBS）和轉錄組學（RNA-seq）：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析DNA甲基化變化，RNA-seq分析基因表達變化。
結果圖形
（1）長期NPs暴露提升藻類初級生產力
在長達100天的納米塑料（NPs）暴露實驗中，研究人員發現藻類的初級生產力得到顯著提升。藻類細胞數量在nPS、nPS-COOH和nPS-NH?暴露組分別增加了16.50%、13.03%和10.32%。葉綠素a（Chl a）含量增加了11.28%-17.65%。然而，藻類生物量僅nPS和nPS-COOH暴露組增加，nPS-NH?暴露組無顯著變化。藻類的最大相對電子傳遞速率（rETRmax）在nPS和nPS-COOH暴露組中有所增加，且nPS-COOH暴露組的增加幅度最大。藻類通過光合作用固定二氧化碳的能力也得到了增強，這體現在所有三種類型的NPs均提高了RuBisCo活性（49.19%–68.33%）。研究人員還在自然水體中進行了暴露實驗，結果表明，在經過100天的暴露后，nPS和nPS-COOH暴露組的藻類細胞數量、生物量和Chl a均有所增加，這與在超純水制備的培養基中的實驗結果一致。然而，nPS-NH?暴露組的Chl a增加并不顯著，這可能是由于nPS-NH?與自然水體中的有機物結合，減少了與藻類細胞的接觸。
圖1：藻類在長期適應納米塑料（NPs）后的初級生產力。
（A） 藻類在實驗室中適應NPs的實驗設計圖。
（B-G）藻類菌株在實驗室適應期間的（B）葉綠素a（Chl a）含量、（C）藻類細胞數量、（D）葉綠素a含量、（E）生物量、（F）生物體積、（G）最大相對電子傳遞速率（rETRmax）。
（H-J）藻類在適應三種NPs 100天后的（H）RuBisCo活性、（I）藻類細胞數量、（J）葉綠素a含量。（K） 藻類在自然水體培養系統中暴露于三種NPs（100天）后的生物量。
（2）藻類初級生產力的個體性狀分化
為了進一步揭示不同表面電荷的NPs對藻類初級生產力響應的差異，研究人員在個體水平上評估了藻類的葉綠體數量。結果顯示，藻類細胞的平均葉綠體數量并未受到長期NPs適應的影響。盡管在三種NPs暴露組之間葉綠體體積沒有顯著差異，但在nPS暴露組中，從均質藻類群體中出現了兩個具有低水平（P1）和高水平（P2）葉綠體表達的亞群。相比之下，nPS-COOH和nPS-NH?暴露組并未表現出顯著的分化現象。P1亞群（占總細胞數的54.92%）的平均信號強度顯著下降至對照組的67.65%，而P2亞群（占總細胞數的45.08%）則顯著增加至對照組的131.64%。研究人員使用流式細胞儀（FACS）從大量藻類懸浮液中分選出了P1和P2亞群，分選效率超過95%。觀察P1和P2亞群的細胞形態發現，P2的生物體積比P1高出1.41倍。這種在nPS暴露下出現的亞群分化現象可能歸因于藻類的異質性。長期暴露于NPs的藻類與NPs之間的相互作用可能會觸發可遺傳的表型多樣性和生理特征的分化。在長期NPs暴露后，觀察到藻類初級生產力在群體水平上有所提高，而在個體水平上則表現出明顯的性狀分化，這表明藻類基因組在適應NPs的過程中發生了改變。
圖2：藻類在長期適應納米塑料（NPs）后的個體水平性狀分化。
（A）藻類個體初級生產力檢測的示意圖。
（B-C）有無NPs處理的藻類細胞在個體水平上的分布情況。
（D）P1和P2的代表性圖像及生物體積分布統計。
（E）P1和P2中藻類細胞的生物體積。
（3）NPs長期適應后藻類的全基因組DNA甲基化變化
為全面理解藻類初級生產力的提升，研究人員利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術，在單堿基分辨率下分析了小球藻在長期暴露于三種NPs后的DNA甲基化圖譜，并觀察到基因組水平上的變化。在對照組和暴露組中，藻類的甲基化位點數量在10.62M-19.17M，亞硫酸鹽轉化率高于99%，表明原始數據的完整性和可靠性。從平均甲基化率結果來看，與對照組相比，暴露于nPS、nPS-COOH和nPS-NH?的藻類發生高甲基化。5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基化水平也呈現出類似的基因組特征。整體甲基化率從對照組的0.88%顯著上升至nPS、nPS-COOH和nPS-NH?暴露組的0.90%、0.89%和0.90%。更多的高甲基化差異甲基化區域（DMRs）導致甲基化水平增加。5mC主要分布在CG位點（對照組為0.83%，nPS為0.84%，nPS-COOH為0.83%，nPS-NH?為0.84%），其次是CHG和CHH位點。與先前的一項研究類似，無論NPs類型如何，CG位點的甲基化水平和覆蓋率均高于CHG和CHH。因此，與CHG和CHH相比，CG位點更適合用于分析在長期NPs暴露下基因組信息的適應性變化。鑒于相鄰的甲基化位點通常協同作用，基因表達的變化高度依賴于低甲基化和高甲基化DMRs的水平。
圖3：藻類在長期適應納米塑料（NPs）后的DNA甲基化變化。
（A）DNA甲基化和基因表達的示意圖。
（B）5mC在功能基因組區域的相對密度分布。
（C）藻類在有無NPs處理下的平均甲基化率。
（D）暴露于三種NPs后的差異甲基化區域（DMRs）的數量。
（E-G）CG、CHG和CHH的（E）平均甲基化率，（F）甲基化水平，（G）在對照組中的甲基化深度。
（4）藻類DMRs對NPs的適應性變化
研究人員進一步通過比較nPS、nPS-COOH和nPS-NH?組與對照組的CG位點檢測了DMRs。結果顯示， nPS暴露組有534個高甲基化DMRs和209個低甲基化DMRs，nPS-COOH暴露組有497個高甲基化DMRs和310個低甲基化DMRs，nPS-NH?暴露組有660個高甲基化DMRs和470個低甲基化DMRs。因此，在暴露于三種類型的NPs后，高甲基化DMRs的數量均多于低甲基化DMRs。研究人員利用高甲基化區域為每個基因組scaffold構建了甲基化圖譜。DMRs在基因組中的分布顯示出在每個暴露組的所有支架中均呈現出高甲基化趨勢。在DMRs的基因組位點（啟動子、外顯子、內含子、3'UTR和5'UTR）中，位于啟動子和外顯子區域的DMRs數量多于內含子區域。任何NPs處理均能誘導更多的高甲基化DMRs位于啟動子區域，而在內含子區域則較少。為了闡釋DMRs的功能，研究人員利用啟動子相關DMRs關聯基因（DMGs）進行了KEGG功能富集分析。分析結果表明，暴露于NPs后的高甲基化DMRs和低甲基化DMRs均富集在一系列生物代謝過程（如“光合作用”和“甘油脂代謝”）中，這可能與藻類在長期NPs暴露后初級生產力的提升有關。
圖4：差異甲基化區域（DMRs）的分布與功能。
（A）暴露于三種納米塑料（NPs）后，DMRs在基因組scaffold中的分布情況。
（B）DMRs在基因組位點（啟動子、外顯子、內含子、3'UTR和5'UTR）中的分布情況。
（C）在啟動子和genebody區域鑒定的DMRs的KEGG功能富集分析。
（5）藻類長期適應后的轉錄組變化
為將藻類初級生產力的全基因組變化與生理變化聯系起來，研究人員利用RNA-seq技術確定了藻類在長期暴露于三種NPs后的轉錄組變化。轉錄組結果顯示，nPS-COOH暴露組引起的差異表達基因（DEGs）數量顯著多于nPS和nPS-NH?暴露組。此外研究人員還對DEGs進行注釋，并進行基因集富集分析（GSEA）以研究轉錄組變化功能。一系列與氨基酸和肽鏈合成相關通路（如tRNA生物合成、核糖體和核糖體生物合成）被三種類型的NPs抑制，表明所有三種類型NPs都能干擾蛋白質合成。外泌體通路被所有三種NPs上調，這一過程有助于從衰老細胞中清除ROS、氧化脂質和其他有害代謝物，從而重新啟動藻類增殖。光合作用蛋白通路在nPS-NH?處理下顯著下調。這一結果與DMRs富集結果一致（圖4C），可能解釋了為什么在nPS-NH?處理后藻類生物量和生物體積沒有顯著變化（圖1E、F）。
（6）NPs長期適應后基因組變化與基因表達水平的關系
研究人員進一步分析了甲基化組和轉錄組的結果，以揭示藻類在長期NPs暴露下受到影響的分子機制。DMGs和DEGs的整合分析結果揭示了nPS-COOH的DEGs數量多于其他兩組，因此在nPS-COOH暴露組中鑒定出的候選基因最多（69個）。本研究通過啟動子相關DMRs關聯基因（PDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于一系列通路，如蛋白質代謝過程、蛋白水解和含氮有機化合物代謝過程。相比之下，通過genebody（基因體）相關DMRs關聯基因（GDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于催化活性的正向調控、分子功能和水解酶活性等通路。這一結果表明碳和氮的代謝受啟動子區域甲基化調控。這些通路的調控可能代表了藻類對長期NPs暴露的適應性響應，并進一步影響下游功能。基因表達與DNA甲基化之間的Pearson相關性分析結果表明，PDMGs在nPS和nPS-NH?暴露組中與DEGs呈負相關，在nPS-COOH暴露組中則呈正相關。而GDMGs在nPS和nPS-NH?暴露組中與DEGs呈正相關，但在nPS-COOH暴露下則呈負相關。先前研究已經表明，啟動子區域高甲基化和基因體區域的低甲基化會抑制目標基因表達，而啟動子區域低甲基化和基因體區域高甲基化則會促進目標基因表達。nPS和nPS-NH?暴露組中DMRs和DEGs的相關性與先前的研究結果一致，但nPS-COOH暴露組的相關性則與先前研究結果相反。DNA甲基化對轉錄調控的負調控方向表明，nPS-COOH可能會導致藻類基因轉錄沉默，而nPS和nPS-NH?則不會。這表明在長期暴露于不同電荷的NPs后，藻類在基因組水平上的適應策略存在差異。
圖5：長期NP適應后基因組變化與基因表達水平的整合分析結果。
(A) 下調的差異表達基因（DEGs）與啟動子相關高甲基化差異甲基化區域（DMRs）關聯基因（PDMGs）。
(B) 下調的DEGs與基因體相關低甲基化DMRs關聯基因（GDMGs）。
(C) 上調的DEGs與低甲基化PDMRs。
(D) 上調的DEGs與高甲基化GDMRs。
(E) 對于(A)和(C)中的候選基因進行GO功能富集分析；
(F) 對于(B)和(D)中的候選基因進行GO功能富集分析；
(G) 暴露于三種NPs后，每個基因的基因表達與DNA甲基化之間的Pearson相關性分析。
討論和啟示
與短期高濃度暴露相比，長期低濃度暴露更能反映納米塑料在環境中的真實影響。DNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾，可能通過調控基因表達幫助藻類適應納米塑料的長期暴露。納米塑料可能通過增強藻類初級生產力，影響水生生態系統的碳循環和能量傳遞。本研究結果提示，納米塑料的生態毒理學評估需要考慮長期低濃度暴露的影響。
WGBS和RNA-seq技術為揭示藻類對納米塑料的適應性機制提供了重要工具
WGBS：通過全基因組重亞硫酸鹽測序，研究揭示了藻類在納米塑料長期暴露下的DNA甲基化變化，為理解藻類的表觀遺傳適應機制提供重要數據。
RNA-seq：通過轉錄組測序研究分析藻類基因表達的變化，揭示納米塑料對藻類生理功能的影響。
整合分析：WGBS和RNA-seq技術的關聯分析，從基因組和轉錄組兩個層面全面解析藻類對納米塑料的適應性機制，為環境應激下的生物適應性研究提供了新的方法和理論基礎。
參考文獻：
Liu S, Huang X, Han J, Yao L, Li H, Xin G, Ho SH, Zhao J, Xing B. Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics. ACS Nano. 2024 Oct 19. doi: 10.1021/acsnano.4c09709.
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