Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells

Keywords: AMPK; KLF4; ePIgenetics; GCKR; glycolysis.

內皮細胞覆蓋動脈管腔并直接接觸血流，其中動脈直段的脈動切應力（PS）維持內皮穩態，而分叉彎曲處的振蕩切應力（OS）會引發內皮功能障礙，表現為糖酵解增強、炎癥、增殖及活性氧生成，進而導致動脈粥樣硬化。糖酵解作為內皮主要能量來源，其異常與多種疾病相關，盡管已有研究表明切應力通過 KLF2、HIF-1α 等因子調節糖酵解，但不同血流模式下的系統調控機制仍不明確。

KLF4 和 AMPK 是內皮機械轉導的關鍵分子：KLF4 作為先鋒轉錄因子，在 PS 作用下可激活抗動脈粥樣硬化基因并重塑染色質；AMPK 作為代謝調控因子，通過磷酸化靶蛋白調節能量穩態。糖酵解限速酶 HK1 可被 GCKR 結合抑制，而 GCKR 的表達和修飾動態調控糖酵解速率。

鑒于此，研究團隊對 KLF4 和 AMPK 在通過 GCKR 調節 EC 糖酵解中的作用進行調查，并在高運動量小鼠的血管健康中進行驗證。發現 PS 可通過 KLF4 介導的表觀遺傳和轉錄調控上調 GCKR 表達，并通過 AMPK 磷酸化 GCKR 增強其與 HK1 的結合，從而抑制糖酵解。研究成果發表于PNAS 期刊題為“Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells”。



首先，研究團隊通過分析 RNA 測序數據和 qPCR 驗證發現，脈動切應力（PS）可從 16 小時起顯著下調人臍靜脈內皮細胞中糖酵解途徑相關酶的基因表達，而振蕩切應力（OS）則呈現相反作用（圖 1A和1B） 。結合 ATAC-seq 實驗進一步證實，PS 對糖酵解基因的抑制與染色質結構重塑相關 —— 在 OS 作用下，糖酵解基因啟動子區域的染色質解聚程度（ATAC 峰富集）顯著高于 PS 處理組（圖 1C）。這表明 PS 在表觀遺傳和轉錄水平上系統性抑制內皮細胞的糖酵解過程，為揭示血流動力學調控血管代謝的分子機制提供了證據。

圖 1 PS抑制ECs中糖酵解基因的表達。

進一步研究發現，PS可顯著誘導內皮細胞中葡萄糖激酶調節蛋白（GCKR）的轉錄（圖 2A 和2B)，且該過程由先鋒轉錄因子 KLF4 介導。PS 處理使 GCKR 啟動子區域的 H3K27ac 組蛋白修飾富集（圖 2C） ，提示染色質結構解聚以促進轉錄激活。通過分析轉錄因子結合位點及 RNA 測序數據，發現 KLF4 是 PS 誘導下與 GCKR 啟動子結合最顯著的轉錄因子（圖 2D和2E） 。過表達 KLF4 可增強其與 GCKR 啟動子的結合并上調 GCKR 表達（圖 2 F-H） ，而敲低 KLF4 則削弱 PS 對 GCKR 的誘導作用（圖 2 I 和 J） 。與這些結果一致，PS 增加了 KLF4 與 GCKR 啟動子的結合并增強了 GCKR 表達（圖 2 B, K 和 L）。 在小鼠體內，抗動脈粥樣硬化血流模式下的胸主動脈內膜中 GCKR mRNA 水平顯著高于致動脈粥樣硬化區域的主動脈弓（圖 2M） 。這些結果表明 PS 誘導的 GCKR 依賴于 KLF4 介導的表觀遺傳和轉錄調控。
 

圖2 KLF4 響應PS調節GCKR的表達。

接著，為了確定 PS 誘導的 GCKR 是否涉及蛋白質磷酸化，研究人員通過生物信息學預測和體外激酶實驗證實，AMPK 能直接磷酸化 GCKR 的 Ser-481 位點，該位點與 AMPK 磷酸化共有序列高度同源，突變該位點會顯著減弱磷酸化水平（圖 3A和3B） 。在細胞實驗中，PS 處理可增強 GCKR Ser-481 磷酸化，而 AMPK 敲除則消除了這一效應（圖 3C） 。功能上，磷酸化的 GCKR（如 S481D 模擬物）可增強與 HK1 的結合，抑制 HK1 活性，而未磷酸化的 S481A 則削弱這種相互作用并提升 HK1 活性（圖 3D和3E） 。體內實驗進一步表明，AMPKα2 存在時，小鼠胸主動脈中 GCKR Ser-481 磷酸化及與 HK1 的結合顯著增加（圖 3 F 和 3G） 。總之，PS 通過激活 AMPK 介導 GCKR Ser-481 磷酸化，促進 GCKR 與 HK1 結合以抑制糖酵解關鍵酶活性，揭示了翻譯后修飾在血流動力學調控血管代謝中的關鍵作用。
 

圖 3 AMPK 磷酸化并調節GCKR 。

最后，為了證實 KLF4-AMPK/GCKR 在體內抑制內皮細胞糖酵解，研究人員通過高跑量（HR）小鼠模型進行驗證。HR 小鼠因心輸出量增加，主動脈中脈動切應力（PS）升高，伴隨 AMPK 活性增強。實驗顯示，HR 小鼠主動脈中糖酵解相關基因表達下調（圖 4A） ，而 KLF4 與 GCKR 啟動子結合增強，導致 GCKR 的 mRNA 和蛋白水平顯著升高（圖 4B-D） 。同時，AMPK 介導的 GCKR Ser-481 磷酸化及 GCKR-HK1 結合作用增強（圖 4 E 和 F） ，進而降低 HK1 活性（圖 4G ）。這表明有氧運動 可能有益于血管內皮的能量利用，且這種有益結果由 GCKR 表達和活性的增加介導。其潛在機制應分別包括 KLF4 在轉錄水平和 AMPK 在翻譯后水平的調節（圖 5）。

圖  4 KLF4-AMPK/GCKR對HR 小鼠糖酵解的抑制作用。

圖5 PS通過 KLF4 和 AMPK 抑制ECs糖酵解的示意圖。

總之，文章闡明了血流通過機械轉導調控血管內皮糖酵解的機制：抗動脈粥樣硬化的脈動切應力（PS）在體外和體內均可抑制內皮細胞的糖酵解。具體而言，PS 可上調糖酵解抑制劑 GCKR 的表達，同時下調其他糖酵解相關基因。機制上，PS 誘導的先鋒轉錄因子 KLF4 通過表觀遺傳重塑 GCKR 啟動子，促進其轉錄激活；同時，PS 激活的 AMPK 可磷酸化 GCKR，增強其與糖酵解關鍵酶己糖激酶的結合，從而抑制糖酵解通量。本研究為血流動力學調控血管代謝及運動干預血管健康提供了新的理論基礎。

參考文獻：Han Y, He M, Marin T, Shen H, Wang WT, Lee TY, Hong HC, Jiang ZL, Garland T Jr, Shyy JY, Gongol B, Chien S. Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 May 25;118(21):e2103982118. doi: 10.1073/pnas.2103982118. PMID: 34001623; PMCID: PMC8166073.

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8166073/

Impact Factor: 9.4

ISSN: 0027-8424 (Print); 1091-6490 (Electronic)

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