多光子顯微技術結合寬場熒光導航系統實現對自由活動動物的高效成像_abio生物試劑品牌網
熒光成像技術，包括單光子（1P）、雙光子（2P）和三光子（3P）顯微鏡技術，極大地推動了神經科學的發展。特別是微型化熒光顯微鏡的出現，開啟了自由活動動物中神經元結構和活動觀察的新范式。得益于單光子激發的高效率，微型化單光子顯微鏡（m1PM）能夠使用LED光源實現數毫米范圍的照明及相應的成像視場（FOV）。然而，由于缺乏光學切片能力，m1PM的體內成像的分辨率有限，無法觀察樹突棘等精細結構。 雙光子成像技術 具有固有的光學切片能力和深層組織穿透能力，其中微型化 雙光子顯微鏡 （m2PM）已實現在自由活動小鼠大腦中對神經元突觸的成像。該技術進一步發展將成像視場擴大至1×0.8mm 2 ，實現了同步三色成像，并達到854μm的成像深度。此外，微型化三光子顯微鏡（m3PM）利用三光子效應，使成像深度突破1mm。
微型化多光子顯微鏡在自由活動動物成像中扮演著日益重要的角色，然而，其實踐應用仍面臨諸多挑戰。多光子顯微鏡優異的光學切片能力導致其景深較淺（3至20μm，由軸向分辨率確定），成像視野通常在1mm2以內。在缺乏引導的情況下，要在跨越數毫米顱窗或梯度變折射率透鏡（GRIN Lens）的三維空間中，快速定位目標感興趣區域（ROI）仍具挑戰性。尤其是對于缺乏經驗的研究者而言，確認ROI并將微型化顯微鏡安裝到小鼠頭部可能耗費數十分鐘甚至數小時，這極大限制了該技術在自由活動動物研究中的進一步應用。
為解決這一問題，開發團隊在早期的工作中將寬場（WF）物鏡與m2PM頭戴式裝置的微型化物鏡（FHIRM-TPM）相結合，創建了用于定位的寬視場熒光成像裝置。然而，由于早期的微型化物鏡的視場有限（約150μm），在幾毫米寬的顱窗內仍難以快速找尋感興趣區域。此外，在切換至m2PM成像時，由于寬視場物鏡的工作距離有限（約37.5mm），需要對光纖進行較大的彎曲，這使得操作更具挑戰性。近期，Zong等人引入了旋轉臺來固定m2PM頭戴裝置，通過角度調整實現與某些特定的腦區更好的對準。盡管取得這些進展，但在三維腦組織中快速定位感興趣區仍存在挑戰，給新研究人員帶來了陡峭的學習曲線。此外，當前m2/3PM的工作距離小于2mm，當使用z軸平臺定位焦平面時，樣本或物鏡極易受損，對經驗不足的用戶尤為明顯。總的來說，亟需開發一種具有增強引導功能的多模態成像平臺，并建立標準化工作流程，以實現對自由活動動物的高效成像。
多模態熒光成像平臺的系統設計
為解決這一問題，開發團隊設計了多模態熒光成像平臺，將寬場熒光導航系統（WF-Nav）與微型化雙光子顯微成像和微型化三光子顯微成像進行了整合。為充分發揮單光子激發的優勢，WF-Nav系統配備了大視場和單細胞分辨率功能，可快速識別指定感興趣區域。一旦定位到目標區域，系統可無縫切換至雙光子或三光子成像，進一步實現高信噪比或深層神經元成像。隨后將m2PM或m3PM探頭固定于小鼠頭部，釋放小鼠進行自由活動成像。
圖1.多模態熒光成像系統設計
寬場熒光導航系統設計
WF-Nav系統由一臺多色大視場寬場顯微鏡和多功能適配器組成。該系統采用三個LED作為激發光源（405nm，473nm，561nm），并配備高數值孔徑的非球面聚光透鏡對LED光束進行準直，每個激發光路均配有相應的濾光片組。為實現大視場導航并為無縫切換多光子鏡組提供充足空間，開發團隊設計了一款長工作距離、低倍率的干式物鏡。該物鏡（3.3x）采用反遠攝設計：前組為兩片膠合雙合透鏡提供負光焦度，后組由單片球面透鏡構成。這種結構將主平面后移以校正色差，在保持數值孔徑的同時實現了超長有效焦距的工作距離，最終達成90mm工作距離的突破性指標，并實現了Φ5.64mm的最大成像視場。
圖2.寬場熒光顯微鏡設計
為實現寬場模式與多光子成像模式間的無縫切換，該團隊設計了一款多功能適配器。該適配器連接寬場物鏡，并在Z軸電動平臺上進行焦距調節。通過標準化的m2/3PM探頭設計，探頭可穩固的安裝在同一支架上，并保證了多光子與寬場模式切換時的齊焦成像。
圖3.多功能適配器與齊焦功能
此款90mm工作距離的物鏡為操作頭件、光纖或加裝可拆卸電動變焦透鏡模塊提供了充足空間。頭件支架安裝在滑動阻力極小（約0.1N）、伸縮距離12 mm的輕型直線滾珠滑軌上，可有效避免物鏡與樣本的碰撞風險。通過更換頭件支架，系統可兼容不同頭件，如mini2P和m3PM。此外，得益于微型化化雙光子顯微鏡的尺寸與可回縮設計，相較于常規臺式物鏡，該系統在大多數方向上提供了更大的觀察角度，從而帶來了更廣的樣本觀察范圍。這一設計顯著提升了樣本的粗定位效率。
圖4.不同物鏡與微型化雙光子顯微鏡觀察角的對比
接下來，開發人員評估了寬場熒光顯微鏡的光學性能與實際應用。對Thy1-YFPH小鼠的腦切片進行成像，可以清晰識別出神經元和軸突。在470nm波長下進行活體鈣離子成像，561nm波長下進行形態學成像，成功捕獲了3804個GCaMP6f標記的神經元以及4650個表達mCherry的小鼠星形膠質細胞。這些結果證明了該寬場顯微鏡具備多色、單細胞分辨率和高通量成像能力，并提供了對感興趣目標區域導航的出色性能。
圖5.微型化寬場顯微鏡高通量成像
標準化微型多光子顯微成像流程建立
為了讓自由活動小鼠中的m2PM成像工作更加順暢，開發人員建立了一套標準化成像流程，以提高自由活動動物中m2PM成像的效率。首先對動物進行病毒注射和外科手術操作，如顱窗植入或GRIN Lens植入，隨后等待2-4周確保病毒充分表達及手術損傷恢復。以某次實驗為例，我們在初級運動皮層（M1）神經元中標記了GCaMP6s和mCherry，隨后將小鼠固定于WF-Nav裝置下的跑步機上。接著通過寬場顯微鏡定位目標感興趣區域并將其對準視野中心。隨后通過適配器切換至m2PM模式，在920nm和1030nm波長下進行雙色雙光子成像，最后對XY軸和焦平面進行精細調整，可以在幾分鐘內確認最終的目標區域。大多數情況下，會將目標焦平面抬高約25μm，以補償水泥收縮導致的焦點偏移，再將Baseplate固定在動物頭部的頭件上，經過約10分鐘的固化后，小鼠即可進行自由活動成像。
圖6.標準化自由活動微型雙光子顯微成像流程
開發人員通過小鼠社交實驗中對神經元的鈣信號和結構進行成像，驗證了該系統，整個安裝操作過程耗時約20分鐘，成功率高達100%（n=15），即使是沒有經驗的研究人員也能輕松掌握，從而極大提高了實驗效率。此外，對M1區第2層神經元和星形膠質細胞進行了多天重復成像，結果顯示在不重新安裝Baseplate的情況下，視野配準穩定。
圖7.多天相同視野成像
得益于標準化的機械設計，m3PM成像頭能夠便捷地安裝在支架上。應用多功能適配器，可實現從寬場模式到三光子成像模式的無縫切換。由于寬場單光子顯微鏡成像深度存在局限，深層信號往往難以探測；雖然淺表血管可作為一定參考，但保留表層的病毒注射區域能提供更直接的熒光標記，有助于在垂直軸上對準更深部位。開發人員在頭部固定、表達GCaMP6f的小鼠中，成功從皮層表面記錄到深達1020μm的postsubiculum區神經活動，并進行小鼠曠場行為探索實驗，在670μm深度處記錄長時間鈣信號活動。
圖8.微型化三光子固定與自由行為成像
該工作由北京信息科技大學吳潤龍教授（通訊作者）、北京大學王愛民、程和平教授等人完成。
【參考文獻】
Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Wide-field fluorescence navigation system for efficient miniature multiphoton imaging in freely behaving animals. Neurophotonics. 2025;12(2):025018. doi:10.1117/1.NPh.12.2.025018
超維景將把寬場導航系統應用于其推出的微型化多光子 SUPERNOVA全系產品，包括SUPERNOVA-100、SUPERNOVA-600、SUPERNOVA-3000、SUPERNOVA-SMART 等。使所有微型化多光子顯微鏡用戶在實際成像過程中，能夠實現更便捷、更安全、更高效的操作體驗。
SUPERNOVA全系產品
一體式微型化雙光子顯微成像系統
SUPERNOVA-100
集成式微型化雙光子顯微成像系統
SUPERNOVA-600
微型化雙光子顯微鏡(mTPM)
SUPERNOVA-SMART
微型化三光子顯微成像系統
SUPERNOVA-3000
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