2025 年 6 月 16 日，同濟(jì)大學(xué)大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科王飛龍、李強(qiáng)、郭忠良團(tuán)隊(duì)在Cell Metabolism在線發(fā)表題為“Itaconate promotes inflammatory responses in tissue-resident alveolar macrophages and exacerbates acute lung injury”的研究論文。
該研究揭示了衣康酸在肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）中的獨(dú)特作用：與BMDMs中的抗炎效應(yīng)相反，衣康酸在AMs中促進(jìn)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生并增強(qiáng)NLRP3炎癥小體激活。

南模生物為該研究提供了Itgax-2A-tdTomato-2A-DTR（目錄號：NM-KI-204992）小鼠。

衣康酸（Itaconate）是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物，由免疫應(yīng)答基因1（IRG1）編碼的烏頭酸脫羧酶（ACOD1）催化順烏頭酸脫羧產(chǎn)生。在炎癥反應(yīng)過程中（內(nèi)毒素LPS等刺激下），巨噬細(xì)胞ACOD1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)順烏頭酸向衣康酸的轉(zhuǎn)化。
 

圖1. 衣康酸（ITA）的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制 ^[1]

作為一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種代謝物，可通過與不同的靶蛋白結(jié)合并影響其功能，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。此前的研究主要基于體外培養(yǎng)的BMDM細(xì)胞或巨噬細(xì)胞系，結(jié)果表明衣康酸具有顯著的抗炎功能，包括抑制促炎細(xì)胞因子（如IL-6和IL-12）的產(chǎn)生以及抑制NLRP3炎癥小體的激活等。然而，衣康酸對于組織駐留巨噬細(xì)胞是否具有類似的抗炎效果尚不明確。

為明確這一問題，王飛龍/李強(qiáng)/郭忠良團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了以下研究：

1  Toll樣受體4的激活在AMs中誘導(dǎo)IRG1的表達(dá)和衣康酸的產(chǎn)生
為探究衣康酸在肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）免疫調(diào)節(jié)中的作用，研究者首先驗(yàn)證了Toll樣受體4（TLR4）通路是否可通過誘導(dǎo)IRG1表達(dá)而啟動衣康酸的合成。結(jié)果顯示，LPS處理后Irg1 mRNA水平相較對照組升高約300倍（圖1A），RNA-seq數(shù)據(jù)亦表明Irg1是LPS刺激下表達(dá)上調(diào)最顯著的基因之一（圖1B）。進(jìn)一步通過蛋白水平分析驗(yàn)證了IRG1在LPS刺激后顯著表達(dá)（圖1C）。

為進(jìn)一步明確AMs是否能合成并分泌衣康酸，作者對細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基上清中的衣康酸進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，LPS刺激可誘導(dǎo)AMs細(xì)胞內(nèi)衣康酸合成（圖1D），同時衣康酸也被分泌到上清液中，表現(xiàn)為刺激后衣康酸水平隨時間升高（圖1E）。相比骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDMs），LPS處理后AMs產(chǎn)生的衣康酸水平更高（圖1F）。

AMs的代謝和功能特性受肺氣道和肺泡微環(huán)境（包括其中的代謝物）嚴(yán)格調(diào)控。為評估LPS刺激是否會誘導(dǎo)氣道中衣康酸的產(chǎn)生（這可能對調(diào)控AMs代謝和免疫功能起重要作用），作者對小鼠進(jìn)行氣管內(nèi)滴注LPS以誘導(dǎo)急性炎癥性肺損傷，隨后收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）以檢測體內(nèi)衣康酸的水平。結(jié)果表明，LPS處理后BALF中的衣康酸含量顯著高于對照組（圖1G），Irg1 mRNA與蛋白表達(dá)均顯著升高（圖1H, 1I）。以上結(jié)果表明，LPS刺激在體內(nèi)上調(diào)AMs 中Irg1的表達(dá)，并增加LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中氣道中的衣康酸水平。
 
Fig1. Toll樣受體4的激活在AMs中誘導(dǎo)IRG1的表達(dá)和衣康酸的產(chǎn)生

2 衣康酸促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生
AMs在體外和體內(nèi)受到LPS刺激時，與BMDMs類似地誘導(dǎo)Irg1表達(dá)并合成衣康酸，但衣康酸在AMs中的免疫調(diào)節(jié)功能是否同樣具備抗炎作用還尚未可知。作者首先在BMDMs中證實(shí)了衣康酸的經(jīng)典作用：預(yù)處理衣康酸可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子IL-6和IL-12表達(dá)（圖2A、2B）。然而，在AMs中，作者卻發(fā)現(xiàn)衣康酸在多種濃度作用下IL-6和IL-12分泌增強(qiáng)，且具有劑量依賴性（圖2C和2D），TNF-α水平并無未受到顯著影響（圖2E）。此外，作者發(fā)現(xiàn)該相反的效果與細(xì)胞活力無關(guān)（圖2F和2G）。

為進(jìn)一步分析衣康酸對AMs激活的影響，作者對經(jīng)預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理的AMs在LPS刺激后進(jìn)行了RNA測序分析。結(jié)果表明，衣康酸處理組AMs中，IL-6、IL-12、IL-1β、IL-18等多種促炎因子以及CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL10等趨化因子的表達(dá)水平顯著升高（圖2H和2I）。GO功能注釋進(jìn)一步表明，LPS+衣康酸處理組中差異表達(dá)基因高度富集于與免疫應(yīng)答相關(guān)的生物過程（圖2K）。以上結(jié)果提示，衣康酸在AMs中具有促炎作用，該特性與其在BMDMs中的抗炎作用相反。
 

Fig2. 衣康酸促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

3 衣康酸促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活
以往研究表明，衣康酸除抑制IL-6和IL-12的表達(dá)外，還可抑制BMDM中NLRP3炎性蛋白質(zhì)體的激活。衣為進(jìn)一步探究衣康酸是否會促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活，作者采用衣康酸預(yù)處理聯(lián)合LPS加ATP刺激的方法。結(jié)果表明，在BMDMs中，衣康酸處理抑制了NLRP3炎癥小體激活的終末產(chǎn)物——成熟IL-1β的產(chǎn)生（圖3B），而在AMs中，衣康酸顯著增強(qiáng)了IL-1β的成熟與分泌，并且具有劑量依賴性（圖3C），提示衣康酸對AMs的促炎作用比促進(jìn)IL-6和IL-12的產(chǎn)生更廣泛。

在NLRP3炎癥小體通路中，成熟IL-1β的生成主要受兩個信號步驟控制：第一個為原IL-1β的誘導(dǎo)表達(dá)（priming，信號1），第二個為炎癥小體的激活并介導(dǎo)其剪切成熟（activation，信號2）。為明確了衣康酸如何通過影響這兩個信號來增強(qiáng)成熟IL-1β的生成，作者進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。結(jié)果表明，僅在較高劑量下，衣康酸才能促進(jìn)AMs中原IL-1β（pro-IL-1β）表達(dá)（圖3D），與較低劑量誘導(dǎo)的成熟 IL-1β 產(chǎn)生增加不成比例（圖3C），提示其主要作用可能集中在激活步驟。為驗(yàn)證這一假設(shè)，作者使用表達(dá)熒光融合蛋白的AMs（ASC-citrine）進(jìn)行可視化檢測，以監(jiān)測ASC寡聚體斑點(diǎn)（ASC speck）的形成，后者是NLRP3炎癥小體激活過程中的關(guān)鍵事件。結(jié)果表明，衣康酸顯著促進(jìn)NLRP3介導(dǎo)的ASC寡聚化。同時，Western blot結(jié)果也表明，衣康酸可增強(qiáng)caspase-1與GSDMD的剪切，分別形成其活性片段p10及GSDMD-N-terminal（圖3F）。以上結(jié)果提示，衣康酸通過促進(jìn)炎癥小體激活而增強(qiáng)IL-1β成熟與釋放。
 

Fig3. 衣康酸促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活

4 內(nèi)源性衣康酸增強(qiáng)AMs中NLRP3炎癥小體的激活
在前面的研究中，作者發(fā)現(xiàn)外源添加衣康酸可促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）的促炎反應(yīng)，那是否AMs自身合成的內(nèi)源性衣康酸也具有相同作用呢？作者對此進(jìn)行了進(jìn)一步探究，結(jié)果顯示，在LPS刺激3小時后，WT AMs產(chǎn)生大量衣康酸，而Irg1^-/- AMs幾乎不產(chǎn)生衣康酸且成熟IL-1β較少，說明IRG1是AMs中衣康酸合成所必需的（圖4A）。同時，外源補(bǔ)充衣康酸可恢復(fù)Irg1^-/- AMs中IL-1β的產(chǎn)生（圖4D和4E）。進(jìn)一步證明內(nèi)源衣康酸可促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活。
 

Fig4. 內(nèi)源性衣康酸增強(qiáng)AMs中NLRP3炎癥小體的激活

5 衣康酸的促炎活性不依賴于NRF2與GSDMD通路，而與SDH抑制密切相關(guān)
為進(jìn)一步闡明衣康酸在AMs中誘導(dǎo)促炎反應(yīng)的分子機(jī)制，研究者首先檢測了轉(zhuǎn)錄因子NRF2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）介導(dǎo)的抗氧化通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NRF2缺失（Nrf2-/-）的AMs中，衣康酸仍能顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的IL-6與IL-12表達(dá)（圖5A、5B），并促進(jìn)NLRP3炎癥小體激活（圖5C），表明該促炎作用并不依賴于NRF2信號通路。進(jìn)一步探究表明，衣康酸在AMs中的促炎作用可能主要源于其對SDH活性的抑制，而非通過NRF2或GSDMD通路。

鑒于衣康酸在AMs中呈現(xiàn)促炎效應(yīng)，而在BMDMs中則表現(xiàn)為抗炎作用，作者推測AMs對衣康酸的特殊響應(yīng)可能源自其所處的肺泡微環(huán)境。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者觀察了AMs在不同體外培養(yǎng)時長下對衣康酸的應(yīng)答。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LPS+ATP刺激下，AMs在分離后24小時內(nèi)仍能顯著響應(yīng)衣康酸促進(jìn)IL-1β產(chǎn)生，但這一效應(yīng)在體外培養(yǎng)3天后明顯減弱，7天后基本消失（圖5P、5Q），提示AMs對衣康酸的促炎作用依賴于體內(nèi)肺泡環(huán)境。
 

Fig5. 衣康酸的促炎活性不依賴于NRF2與GSDMD通路，而與SDH抑制密切相關(guān)

6 衣康酸通過增強(qiáng)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I（ETC-CI）活性促進(jìn)AMs中的炎癥反應(yīng)
為探究衣康酸在肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）中促炎作用的代謝機(jī)制，作者對移植前后的CD45.2+ BMDMs進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序。結(jié)果顯示，移植至肺泡腔的BMDMs氧化磷酸化（OXPHOS）通路呈顯著正相關(guān)，提示肺泡微環(huán)境促使巨噬細(xì)胞依賴OXPHOS以適應(yīng)低葡萄糖環(huán)境。代謝分析進(jìn)一步表明，AMs在LPS刺激下仍維持OXPHOS，不發(fā)生糖酵解轉(zhuǎn)移，且乳酸水平不變，但TCA中間產(chǎn)物積累，顯示其代謝特征與BMDMs不同。

衣康酸可抑制琥珀酸脫氫酶（SDH），而SDH是線粒體呼吸鏈的重要組分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衣康酸處理未降低AMs的基礎(chǔ)耗氧速率（OCR），反而提高ATP水平，提示其通過增強(qiáng)電子傳遞鏈復(fù)合物I（ETC-CI）活性維持能量代謝。RNA-seq和代謝分析支持這一假設(shè)，表明衣康酸可增強(qiáng)ETC-CI介導(dǎo)的呼吸活性。使用ETC-CI抑制劑PIericidin A可顯著降低AMs的OCR，并抑制IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，說明ETC-CI在衣康酸介導(dǎo)的促炎反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。
 

Fig6. 衣康酸通過增強(qiáng)ETC-CI活性促進(jìn)AMs中的炎癥反應(yīng)

7 衣康酸加劇LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷并促進(jìn)人源AMs中IL-1β的產(chǎn)生
肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）是宿主防御系統(tǒng)的重要組成部分，能快速響應(yīng)病原體或危險信號并啟動炎癥反應(yīng)，但在病理狀態(tài)下也可能加劇組織損傷。前面的研究已證實(shí)，衣康酸在體內(nèi)可增強(qiáng)AMs的促炎反應(yīng)。作者進(jìn)一步評估了該效應(yīng)在體內(nèi)的病理生理相關(guān)性。小鼠在接受衣康酸預(yù)處理后，再給予LPS誘導(dǎo)急性肺損傷，結(jié)果顯示肺組織損傷加重，灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-12水平顯著升高，而TNF-α無明顯變化。分離的AMs也表現(xiàn)出更高的促炎因子表達(dá)。

為確認(rèn)AMs是否為衣康酸促炎作用的關(guān)鍵靶細(xì)胞，作者分別使用脂質(zhì)體氯膦酸和Itgax-2A-tdTomato-2A-DTR（NM-KI-204992）小鼠（該品系在全CD11c啟動子調(diào)控下表達(dá)白喉毒素受體DTR）耗竭AMs，結(jié)果均顯示衣康酸的促炎效應(yīng)被完全阻斷，證實(shí)AMs是其主要作用細(xì)胞。此外，Irg1-/-小鼠在致死劑量LPS處理后的生存率高于野生型，提示內(nèi)源性衣康酸加重肺損傷。人源AMs實(shí)驗(yàn)也顯示衣康酸顯著促進(jìn)IL-1β釋放，表明其促炎作用具有跨物種一致性。

綜上，衣康酸通過作用于AMs增強(qiáng)其促炎功能，加劇LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，這一作用在小鼠和人類中均存在，提示其在臨床應(yīng)用中需謹(jǐn)慎評估其潛在的促炎風(fēng)險。
 

Fig7. 衣康酸加劇LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷并促進(jìn)人源AMs中IL-1β的產(chǎn)生

綜上所述，本研究明確揭示衣康酸在AMs中具有顯著的促炎功能，能夠加劇LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，其效應(yīng)依賴于AMs的存在，并在小鼠與人類中均表現(xiàn)一致。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了衣康酸傳統(tǒng)的“抗炎代謝物”認(rèn)知，提示在其臨床轉(zhuǎn)化過程中需警惕其在肺部微環(huán)境中可能引發(fā)的促炎作用。

圖8. 衣康酸在AMs中的作用機(jī)制

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Reference：
[1] Ye D, Wang P, Chen LL, Guan KL, Xiong Y. Itaconate in host inflammation and defense. Trends Endocrinol Metab. 2024;35(7):586-606. doi:10.1016/j.tem.2024.02.004
[2] Shan M, Zhang S, Luo Z, et al. Itaconate promotes inflammatory responses in tissue-resident alveolar macrophages and exacerbates acute lung injury. Cell Metab. Published online June 14, 2025. doi:10.1016/j.cmet.2025.05.012

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