Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer

Keywords: liver cancer; metastasis; miRNA-5703; portal hypertension; pressure; proliferation.

肝癌是全球癌癥相關死亡第三大原因，男女死亡率合計 8.2% 。免疫抑制劑治療肝癌反應率低，腫瘤微環(huán)境是關鍵干擾因素，其中物理線索作用未明。門靜脈高壓癥（PHTN）是肝癌公認危險因素與獨立預測因子，會增加肝竇生物壓力，破壞腫瘤微環(huán)境機械平衡，但其調節(jié)肝癌細胞增殖和轉移機制不明。壓力影響實體瘤生長侵襲，此前研究心血管和骨科疾病中機械響應 miRNAs ，肝癌中壓力反應 miRNA 功能待探索。SRC 自磷酸化等信號通路與癌癥進展轉移相關。前期研究發(fā)現(xiàn) 15 mmHg 壓力作用 24 小時可促進肝癌細胞系增殖、遷移和侵襲，篩選出相關 miRNAs 和mRNA 。基于此，南京大學金陵醫(yī)院消化內肝病科的研究團隊通過體內外實驗探究壓力反應 miRNA - 5703 在肝癌生長和轉移中的作用及機制，發(fā)現(xiàn)其過表達或抑制肝癌機械依賴性發(fā)展，為其與免疫抑制劑聯(lián)合應用提供理論基礎。研究成果發(fā)表在Journal of Cancer 期刊，題為“Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer”。


首先，使用 MicroDB、MicroTarBase 和 TargetScan 三個網(wǎng)站，對通過 miRNA 微陣列鑒定出的五個壓力敏感型 miRNA（miRNA-5703、miRNA-630、miRNA-7641、miRNA-7-5p 和 miRNA-4485-3p）的靶基因進行預測，分別得到 1213、10679 和 1222 個靶基因（圖 1A）。綜合共 11526 個基因，其中 1309 個與通過 mRNA 微陣列鑒定出的差異表達 mRNA 相對應（圖 1B），且差異表達的預測靶基因中有 SRC 基因。

對這 1309 個靶基因進行 KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)與癌癥生長和轉移相關的前三條通路為FA通路、PI3K 通路和 FOXO 通路（圖 1C），且這三條通路共同上游基因為 SRC，也是在壓力負荷下表達下調的 miRNA-5703 的預測靶基因之一。

使用 mRNA 微陣列檢測對照組（培養(yǎng) 24 小時的 HepG2 細胞）和壓力處理組（15 mmHg 壓力下處理 24 小時的細胞）的變化，得到與三條通路相關的差異表達基因聚類熱圖（圖 1D），顯示 PTK2、PI3K、PIK3R1、SRC 和 SGK3 在受壓肝癌細胞中表達上調，F(xiàn)OXO1、CDKN1B、P27Kip1 表達下調，PDK1 表達無顯著變化，且通過 RT-qPCR 在 HepG2 和 Huh-7 細胞系中驗證了這些基因表達（P < 0.05 或 P < 0.01） 。
 

圖1 壓力誘導信號通路的預測。

隨后，通過 miRNA 芯片和 mRNA 微陣列檢測發(fā)現(xiàn)，受壓 HepG2 細胞中 miRNA - 5703 表達下調約 0.68 倍（圖 1F），SRC 表達上調約 8.87 倍（圖 1G）。利用 RT - qPCR 在 HepG2、Huh - 7 和 MHCC97H 三種肝癌細胞系中驗證了該芯片結果（圖 2A，P <0.05，P < 0.01 或 P < 0.001；圖 2B，P < 0.05），而在正常肝細胞系 HL - 7702 中，miRNA - 5703 和 SRC 的表達無顯著變化（圖 2A，P> 0.05；圖 2B，P > 0.05）。

Western blotting 表明，miRNA - 5703 過表達可抑制 HepG2 和 Huh - 7 細胞中 SRC 的表達（圖 2C 和 2D，P <0.05）。利用 TargetScan 網(wǎng)站預測出 miRNA - 5703 在 SRC 3' 非翻譯區(qū)第 1745 - 1751 位核苷酸的 7mer - m8 型結合位點（圖 2E）。通過將野生型和突變型質粒轉染至 HEK293T 細胞并檢測熒光素酶信號比值，在 SRC 中野生型結合位點的 miRNA - 5703 過表達后，該比值降低了 43.69%（圖 2F，P < 0.001），而結合位點突變后 miRNA - 5703 過表達前后該比值沒有顯著差異（圖 2F，P> 0.05）。

研究收集不同巴塞羅那臨床肝癌分期（BCLC）患者的肝癌及癌旁正常組織樣本，對比發(fā)現(xiàn)：與 BCLC A1 期（無門靜脈高壓，PHTN）患者相比，A2 - D 期（有門靜脈高壓）患者的肝癌組織中，miR - 5703 表達被抑制（圖2G，P <0.05），SRC 的 mRNA 水平更高（圖2I，P < 0.05） ，且這一差異在癌旁正常組織中不顯著（圖 2H和2J,P > 0.05)。進一步分析配對組織發(fā)現(xiàn)，A1 期和 A2 - D 期多數(shù)患者的肝癌組織中 SRC 表達高于癌旁正常組織，其中相當比例患者肝癌組織的 SRC 呈高表達（> 2 倍）（圖2K和2L）。

 圖2 驗證 SRC 作為 miRNA-5703 的靶基因。

為了研究 HepG2 和 Huh-7 細胞系的增殖情況，采用流式細胞術進行檢測檢測。結果發(fā)現(xiàn)，miRNA-5703 過表達顯著降低 HepG2 和 Huh-7 細胞處于 S 期的比例，敲低 SRC 也有類似效果。將 HepG2 和 Huh-7 細胞分組處理后，CCK-8 法檢測顯示，miRNA-5703 過表達及敲低 SRC 均能顯著抑制肝癌細胞增殖，而對于受壓的正常肝細胞系 HL-7702 細胞，其生長不受影響（圖3）。

圖3 miRNA-5703 的過表達抑制了壓力誘導的肝癌細胞增殖。

研究壓力對SRC-FAK-FOXO1 信號通路誘導細胞增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn)15 mmHg壓力負荷促進肝癌細胞中 SRC、FAK、PI3K、SGK3 表達，抑制 FOXO1 和 P27Kip1 表達（圖4）。且使 pSRC、pFAK、pPDK1、pSGK3 表達上調，說明壓力不僅 在mRNA 水平上增加影響相關基因轉錄，還激活蛋白磷酸化，同時 PDK1 的 mRNA 表達不受壓力調控但蛋白可被磷酸化。對受壓細胞分別用赫比霉素 A（pSRC 抑制劑）、Gsk2256098（pFAK 抑制劑）、LY294002（PI3K 抑制劑）、PHT-427（PDK1 抑制劑）和 EMD638683（SGK3 抑制劑）進行處理并檢測級聯(lián)反應中上下游蛋白關系。此外，miRNA-5703 過表達或 SRC 敲低會抑制下游蛋白表達，揭示了 miRNA-5703 抑制腫瘤生長的機制（圖5）。

圖4 壓力通過 SRC-FAK-FOXO1 信號通路誘導細胞增殖。

圖5 miRNA-5703 的過表達以及 SRC 基因的沉默逆轉了壓力負荷在特定細胞中所誘導產(chǎn)生的增殖效應。

接下來，研究miRNA-5703 過表達對壓力誘導的肝癌細胞遷移和侵襲的影響。研究將 HepG2 和 Huh-7 細胞系依條件分為對照組、壓力組、壓力 + miRNA-5703（+）組、壓力 + SRC（-）組。細胞劃痕實驗顯示，miRNA-5703 過表達和 SRC 基因敲低均能抑制 HepG2 和 Huh-7 細胞遷移（圖6A）；Transwell 小室實驗表明，miRNA-5703 過表達顯著抑制 HepG2 和 Huh-7 細胞侵襲，SRC 基因敲低對肝癌細胞增殖有類似抑制效果（圖6B），而壓力對 HL-7702 細胞遷移無顯著影響（圖6C）。

圖6 miRNA-5703 的過表達抑制了壓力誘導的肝癌細胞的遷移和侵襲。

外周膜蛋白 GM130 與高爾基體膜緊密相連，參與細胞極化和定向遷移調控。免疫熒光測定顯示，HepG2、Huh-7 和 HL-7702 細胞中 GM130 表達增加（圖7A)。細胞黏附實驗表明，壓力負荷下 HepG2、Huh-7 和 MHCC97H 細胞系黏附于基質的細胞數(shù)量顯著增多（圖7B)。

圖7 壓力負荷對肝癌及正常肝細胞黏附與 GM130 表達的影響。

通過幽靈鉛筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn)，壓力增加 HepG2 和 Huh-7 細胞的細胞骨架微絲數(shù)量，而 miRNA-5703 過表達顯著減少其數(shù)量；免疫熒光顯示，壓力上調黏著斑蛋白紐蛋白表達，miRNA-5703 過表達則顯著抑制受壓細胞中紐蛋白的表達（圖8）。

圖8 miRNA-5703 對肝癌細胞微絲及黏著斑蛋白表達的調控。

15 mmHg壓力下，赫比霉素 A 和 GSK2256098 抑制 HepG2 和 Huh-7 細胞中 paxillin 表達，另三種抑制劑無顯著影響， 這表明 15 mmHg的壓力負荷促進了 HepG2 和 Huh-7 細胞中 SRC 和 FAK 的表達，并且顯著上調了 paxillin 的表達。miRNA-5703 過表達或 SRC 敲低可抑制paxillin 表達，表明這可能是 miRNA-5703 抑制腫瘤轉移的機制（圖9）。

圖9 miRNA-5703 的過表達通過 SRC-paxillin 通路抑制壓力誘導的細胞增殖。

最后，實驗將 MHCC97H 細胞依條件分四組：對照組、壓力組、壓力 + 載體組、壓力 + miRNA-5703（+），將這些細胞皮下注射到小鼠后 10 天成像顯示，受壓細胞組腫瘤大小和重量增加，miRNA-5703 過表達組減小（圖 10A）；肝癌和正常肝組織 HE 染色如圖 10B；蛋白免疫印跡表明，miRNA-5703 過表達組中，壓力上調的 SRC 表達受抑制（圖10C）。
 

圖10 在裸鼠中驗證了壓力對肝癌生長和轉移的影響。

免疫組化檢測表明，壓力處理組腫瘤中 Ki67 表達上調、NM23 表達下調，miRNA - 5703 過表達組則相反（圖10D）。Ki67 與細胞增殖和有絲分裂相關，NM23 可抑制腫瘤轉移，兩者在臨床腫瘤檢測中意義重大。通過 RT - qPCR 評估四組腫瘤中 miRNA - 5703 表達（圖10E），級聯(lián)反應示意圖11所示。

圖11 壓力響應性 miRNA-5703 通過抑制 SRC 表達來促進肝癌生長和轉移的示意圖。

總之，該研究表明miRNA-5703 的上調通過抑制 SRC-FAK-FOXO1 軸和 SRC-paxillin 軸來抑制壓力誘導的肝癌生長和轉移 ，有助于研發(fā)受力學啟發(fā)的肝癌抗癌藥物。

參考文獻：Shen S, Zhou W, Xuan J, Xu W, Xu H, Yang M, Zhu L, Yang Z, Yang B, Shi B, Zhao Y, Wang F. Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer. J Cancer. 2022 Jan 1;13(1):325-342. doi: 10.7150/jca.64926. PMID: 34976193; PMCID: PMC8692678.

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8692678/

Impact Factor: 3.3

ISSN: 1837-9664

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