近日，美國華盛頓喬治敦大學（Georgetown University）Anton Wellstein和Alexander Kroemer團隊合作，研究了循環細胞游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）的甲基化模式在肝臟移植后同種異體移植物（allograft）損傷中的應用。研究團隊通過對44名肝臟移植患者的130份血液樣本進行cfWGBS分析，利用cfDNA片段甲基化模式，追溯其細胞來源，從而揭示移植物損傷的細胞基礎。研究結果表明，cfDNA甲基化模式能夠非侵入性地指示肝臟移植后移植物損傷的細胞來源，并區分不同類型的移植物損傷。相關研究成果以《Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant》為題發表于《Nature Communications》期刊。
 
標題：Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant（cfDNA甲基化模式揭示肝臟移植后同種異體移植物損傷的細胞來源）
發表時間：2025年06月17日
發表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術平臺：cfWGBS（易基因金牌技術）

移植后的并發癥會降低同種異體移植物和受者的存活率。目前用于非侵入性檢測移植器官損傷的方法有限，且無法區分細胞機制。本研究通過分析肝臟移植后由死亡細胞釋放到循環細胞游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）片段，來監測細胞損傷。研究分析了44名患者在移植后不同時間點采集的130份血液樣本。將基于序列的cfDNA片段甲基化模式比對到一個由476個純化細胞的甲基化組（methylomes）來源細胞類型特異性（cell-type-specific）DNA甲基化模式圖譜中。肝臟細胞類型的DNA甲基化模式和多組學數據綜合分析表明在開放染色質和功能重要的調控區域有顯著富集。在沒有移植器官損傷的患者中，多組織細胞損傷在術后第一周內恢復。然而，如果在術后第一個月內持續檢測到肝細胞和膽管上皮細胞cfDNA升高，則表明存在早期移植器官損傷。此外，cfDNA組成變化可以區分移植器官損傷的不同原因，顯示出非侵入性監測和干預的潛力。

易小結
本研究提供了一種新的非侵入性方法，通過分析血液中的cfDNA甲基化模式來監測肝臟移植后的移植物損傷。這種方法不僅可以早期發現移植物損傷，還可以區分損傷的不同原因，為臨床醫生提供了一種新的工具，以更精準地監測和干預肝臟移植后的并發癥。此外，該方法還能夠同時監測其他器官的損傷，如腎臟、心臟和神經系統，為多器官移植后的全面監測提供了可能。
（詳見→深度綜述：cfDNA甲基化在器官和組織損傷檢測中的強大力量）
cfWGBS技術在本研究中不僅提供了單堿基分辨率的DNA甲基化信息，還通過多組學數據整合和片段反卷積分析，精確追溯cfDNA細胞來源，并揭示移植物損傷的早期標志。這種方法為非侵入性監測器官移植后的細胞損傷提供了一種新的、有效的手段，具有重要的臨床應用前景。
 
研究方法

• 樣本收集：從44名肝臟移植患者中收集了130份血液樣本，包括術前、術后即刻、術后7天和30天的圍移植期。樣本分為兩組，一組是28名成年肝臟移植患者在圍移植期的樣本（100份），另一組是16名患者在因并發癥接受肝活檢時的樣本（30份）。
• cfDNA甲基化分析：提取cfDNA，并通過亞硫酸鹽處理后進行全基因組甲基化測序（cfWGBS）。將cfDNA甲基化模式與476個純化細胞的細胞類型特異性DNA甲基化模式圖譜進行比對，擴展了現有的細胞類型特異性DNA甲基化圖譜，包括肝臟中的非實質細胞類型，如肝星狀細胞、肝內皮細胞、肝駐留免疫細胞和膽管上皮細胞。
• 多組學數據整合分析：整合DNA甲基化模式和多組學數據，包括染色質可及性（ATAC-seq）和組蛋白修飾（H3K27ac）數據，驗證甲基化模式與細胞功能和身份的相關性，揭示肝臟細胞類型的甲基化模式在開放染色質和功能重要的調控區域有顯著富集。。
• 片段化反卷積分析（fragment-level deconvolution）：對cfDNA樣本進行反卷積分析，估計不同細胞類型的相對貢獻。

 
結果圖形
1. 肝臟移植后cfDNA甲基化模式提示的細胞損傷
為監測肝臟移植后的細胞損傷，研究團隊28名成年肝臟移植患者中的圍移植期收集連續血液樣本，并在移植后至多一個月的預定時間點對樣本進行了cfDNA甲基化分析（n=100份樣本）。還從出現并發癥的患者身上收集了樣本，并在因臨床指征進行肝活檢（for-cause liver biopsy, FC-bx）以鑒定移植物損傷時，收集16名患者的匹配表型樣本（n=30份樣本）。從這130份樣本中分離出cfDNA片段經亞硫酸鹽處理，通過WGBS測序分析將cfDNA片段化組織和細胞類型來源比對到擴展型細胞類型特異性DNA甲基化圖譜中，來推斷組織損傷并區分移植物損傷的不同原因（圖1）。

研究結果表明，肝臟移植后cfDNA濃度顯著增加，主要來源于肝細胞、肝星狀細胞和內皮細胞。這些細胞類型的cfDNA增加與手術過程中的細胞損傷相關。此外還檢測到神經元和心肌細胞cfDNA的增加，表明移植手術可能對多個器官造成損傷。
 
圖1：使用血液中的cfDNA甲基化模式監測肝臟移植后的細胞損傷研究概述。

1. 從健康組織中純化細胞的476個甲基化組參考數據中鑒定出細胞類型特異性的DNA甲基化模式。這些甲基化模式經過驗證，在染色質開放性和功能重要的調控區域表現出顯著富集，隨后被用于追蹤患者cfDNA片段來源。
2. 第一個月內從28名患者在肝臟移植前后按照預定時間點收集連續血清樣本（n=100份樣本）。此外，還在16名患者的肝活檢證實的移植物損傷時收集血清樣本（n=30份樣本）。通過亞硫酸鹽處理后的cfDNA進行cfDNA甲基化分析（cfWGBS）。
3. 對移植器官以及其他受者器官的細胞損傷進行定量檢測，以監測全身范圍的影響。

 
2. 擴展健康組織的基于測序DNA甲基化圖譜以表征肝細胞類型特異性表觀基因組
研究團隊擴展了現有的DNA甲基化圖譜，包括肝臟中的非實質細胞類型，如肝星狀細胞、肝內皮細胞、膽管上皮細胞和肝駐留免疫細胞。通過全基因組甲基化測序（WGBS），生成了這些細胞類型的甲基化圖譜，為后續分析提供參考。
  圖2：與其他健康組織相比的肝細胞類型DNA甲基化圖譜。

1. 健康人細胞類型的參考全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）數據中鑒定的差異甲基化、細胞類型特異性甲基化區域（DMBs）熱圖。圖中的每個單元格標記了20種細胞類型（列）中每種基因組區域（行）的甲基化評分，每種細胞類型最多顯示50個區域。
2. 突出顯示排名前25的肝細胞特異性DMBs熱圖。
3. 一個肝細胞特異性的低甲基化區域示例（以藍色突出顯示），位于在肝細胞中高表達的ECHS1基因上游（綠色軌跡）。來自UCSC基因組瀏覽器的比對顯示五種不同肝細胞類型以及PBMC樣本的WGBS樣本中平均DNA甲基化（DNAm，紫色軌跡）情況。還展示了肝細胞中的染色質組織標記（藍色軌跡），以顯示可及性（DNA酶I超敏感性，DHS）和調控功能（H3K27ac結合）。
4. 五種不同肝細胞類型的參考WGBS樣本中，肝細胞特異性低甲基化區域的甲基化測序reads片段可視化。

3. 肝細胞類型特異性低甲基化區域與染色質可及性和H3K27ac結合重疊
研究發現，肝細胞類型特異性的低甲基化區域與染色質可及性和H3K27ac結合區域高度重合，表明這些區域在維持細胞類型特異性功能中具有重要作用。這些區域的甲基化模式可以作為細胞損傷的生物標志物。
  圖3：肝細胞特異性低甲基化DNA區域與其他細胞特異性表觀遺傳標記的重合。
  a-b.  肝細胞類型特異性低甲基化區域與染色質可及性及H3K27ac結合的關系。總結圖顯示圍繞每種肝細胞、膽管上皮細胞、肝星狀細胞、肝內皮細胞和肝免疫細胞特異性低甲基化區域的±5kb區域內的DHS/ATAC-seq或H3K27ac標記強度。
c.  在相同細胞類型的chromHMM注釋中，與H3K4me1標記相關標記為增強子的細胞類型特異性低甲基化區域比例。
d.  UCSC基因組瀏覽器比對顯示一個包含FOXA1結合序列的肝細胞特異性低甲基化區域。紫色軌跡顯示WGBS樣本的平均甲基化。
e.  HOMER motif分析在肝細胞類型特異性低甲基化區域中富集先鋒（PIoneer）和發展（development）轉錄因子結合位點。肝細胞的DHS、H3K27ac和H3K4me1數據來自德國表觀基因組計劃（DEEP）。肝細胞的FOXA1 ChIP-seq數據來自ENCODE項目。膽管上皮細胞的ATAC-seq數據和肝星狀細胞的H3K27ac組蛋白修飾數據來自ENCODE項目。
 
4. 先鋒轉錄因子結合位點（TFBS）在肝細胞類型特異性DNA甲基化區域富集
通過motif分析，研究團隊發現肝細胞類型特異性的DNA甲基化區域富含先鋒轉錄因子（如FOXA1/2、PAX7等）的結合位點。這些轉錄因子在細胞發育和命運決定中起關鍵作用，其結合位點的甲基化狀態可能影響基因表達（圖3d、e）。
 
5. 肝臟移植后立即出現的細胞損傷來源
研究團隊通過分析肝臟移植后立即采集的血液樣本，發現cfDNA的主要來源是肝細胞、肝星狀細胞和內皮細胞。這些細胞類型的cfDNA增加與手術過程中的細胞損傷相關。此外，還檢測到神經元和心肌細胞cfDNA的增加，表明移植手術可能對多個器官造成損傷。
  圖4：基于cfDNA片段甲基化模式推斷肝移植后細胞損傷來源。

1. 從28名肝移植患者身上收集的術前和術后即刻（術后第0天，POD0）的連續血清樣本。
2. cfDNA細胞來源的平均估計值。
3. 肝細胞來源的cfDNA與AST和ALT酶活性的相關性（Spearman相關系數分別為r = 0.81，AST；r = 0.82，ALT；雙側檢驗，p = 0.0021，AST；p = 0.004，ALT）。

d-f. 術前（PRE）和再灌注后（POST）來自髓系細胞（d）、肝細胞（e）、內皮細胞（g）、肝星狀細胞（h）和神經細胞（i）的cfDNA比例。以粗體顯示的是患者群體的平均值±標準誤（SEM）。右側軸：相對于術前的變化倍數。(f)從患者血清中分離出的cfDNA濃度。
 
6. 肝細胞和膽管上皮細胞cfDNA的持續升高表明移植物損傷
研究發現，在術后第一個月內，持續檢測到肝細胞和膽管上皮細胞cfDNA的升高與移植物損傷相關。這些cfDNA升高可以作為早期診斷移植物損傷的非侵入性標志物。
  圖5：肝移植后細胞類型特異性損傷的時間進程。

1. 從20名肝移植患者身上收集的術前、再灌注后（術后第0天，POD0）、術后第7天和第30天（POD7，POD30）的連續血清樣本。
2. 移植物損傷的病因。在移植后1年內，20名患者中有11名通過因臨床指征進行的肝活檢被診斷出不同病因的移植物損傷。
3. 肝細胞cfDNA在有移植物損傷（右側，n=11名患者）和無移植物損傷（左側，n=9名患者）的患者中的時間進程。
4. 各個體在POD7和POD30時的平均合并肝細胞cfDNA，按結果分組（移植物損傷 n=11名患者，無移植物損傷n=9名患者）。
5. 膽管cfDNA在有移植物損傷（右側，n=11名患者）和無移植物損傷（左側，n=9名患者）的患者中的時間進程。
6. 各個體在POD7和POD30時的平均合并膽管cfDNA，按結果分組（移植物損傷11名患者，無移植物損傷9名患者）。
7. 在有移植物損傷（右側，n = 11）和無移植物損傷（左側，n = 9）的患者中，五種肝細胞類型cfDNA的時間進程。

 
7. 細胞游離cfDNA甲基化追溯移植物損傷來源
通過分析cfDNA的甲基化模式，研究團隊能夠區分肝細胞和膽管上皮細胞來源的損傷，從而確定移植物損傷的具體類型。這種方法可以為臨床醫生提供更精準的診斷工具，減少對侵入性活檢的依賴。
  圖6：cfDNA甲基化模式提示移植物損傷的細胞來源。

1. 在因臨床指征進行肝活檢（FC-bx）時收集的血清樣本，用于診斷移植物損傷。所有活檢均在肝移植后1年內進行，樣本代表了24名患者（n=30份樣本）。
2. 根據活檢中觀察到的損傷模式對cfDNA的細胞來源進行分類。上方顯示了每種移植物損傷類型檢測到的不同細胞來源的平均比例。下方是列聯堆疊條形圖，展示每個個體樣本中實體器官細胞基因組當量（Geq）比例，其中每個堆疊代表一個不同的樣本，堆疊中每個段落高度代表該細胞類型組在樣本中的相對cfDNA比例。
3. 在有肝細胞或混合肝膽損傷的血清樣本中，與單純的膽管損傷相比，肝細胞cfDNA水平。
4. 在有膽管或混合肝膽損傷的血清樣本中，與單純的肝細胞損傷相比，膽管cfDNA水平。（b–d 血清樣本被分類為n=14份肝細胞損傷，n=10份混合肝膽損傷，n=6份膽管損傷的移植物損傷病因）

e–h. 在有肝細胞、膽管和混合肝膽形式的移植物損傷的患者中，圍移植期細胞損傷的時間進程。與并發癥和肝活檢證實的診斷相對應的時間點用箭頭標記。（e）在術后第15天（POD15）出現COVID-19感染，術后第120天（POD120）因混合損傷分類被診斷為急性細胞排斥（ACR）并伴有高膽紅素血癥的患者。在術前被診斷為肝腎綜合征（HRS）以及術后被診斷為急性腎損傷（AKI）的患者中，檢測到腎臟上皮細胞cfDNA在POD0、POD15和POD30時升高。（f）在術后第1天（POD1）因混合損傷分類被診斷為肝缺血并伴有高膽紅素血癥的患者。AKI通過POD9時升高的肌酐水平和POD30時升高的腎臟上皮細胞cfDNA來指示。（g）在術后第9天（POD9）和第15天（POD15）因肝細胞損傷分類被診斷為急性細胞排斥（ACR）的患者。AKI通過POD8時升高的肌酐水平以及POD7、POD9和POD30時升高的腎臟上皮細胞cfDNA來指示。（h）在術后第43天（POD43）被診斷為膽汁瘤（膽管損傷分類）患者。
 
討論和啟示
本研究結果表明，cfDNA甲基化模式可以作為非侵入性監測肝移植后移植物損傷的有力工具。通過擴展的DNA甲基化圖譜和多組學數據整合，研究團隊不僅能夠早期發現移植物損傷，還可以區分損傷的不同原因，為臨床醫生提供了更精準的診斷工具。此外，該方法還可以同時監測其他器官的損傷，為多器官移植后的全面監測提供了可能。

cfWGBS在本研究中的作用
生成細胞類型特異性的DNA甲基化圖譜：研究團隊利用WGBS技術生成多種肝細胞類型（包括肝細胞、膽管上皮細胞、肝星狀細胞和肝內皮細胞）的單堿基分辨率DNA甲基化圖譜。使研究者能夠精確地識別和量化不同細胞類型中的甲基化狀態。這對于區分不同細胞來源的cfDNA片段至關重要。

驗證甲基化模式與細胞功能的相關性：通過將WGBS數據與染色質可及性（ATAC-seq）和組蛋白修飾（H3K27ac）數據進行整合，研究團隊驗證了肝細胞類型特異性的低甲基化區域與染色質可及性和功能重要的調控區域的重合。這些區域在維持細胞類型特異性功能中具有重要作用。

追溯cfDNA的細胞來源：研究團隊利用WGBS生成的甲基化圖譜，通過片段反卷積分析推斷cfDNA片段的細胞來源。這種方法能夠精確地識別cfDNA片段的組織和細胞類型，從而推斷出肝移植后不同時間點的細胞損傷來源。

揭示移植物損傷的早期標志：WGBS技術使研究者能夠精確地識別cfDNA片段來源，并將其與移植物損傷的不同類型聯系起來。同時能夠提前檢測到移植物損傷信號，為早期診斷和干預提供了可能。

參考文獻：
McNamara, M.E., JAIn, S.S., Oza, K. et al. Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant. Nat Commun 16, 5310 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60507-9