一、犬輪狀病毒（CRV）概述

犬輪狀病毒（Canine Rotavirus, CRV）屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是引起幼犬腹瀉的主要病原之一，尤其對 2-6 周齡幼犬致死率較高。CRV 基因組為分節(jié)段雙鏈 RNA，其外層衣殼蛋白 VP4 和 VP7 是主要抗原蛋白，也是中和抗體的關(guān)鍵靶點。制備高特異性抗 CRV 單克隆抗體（mAb），對病毒檢測、中和機制研究及抗病毒藥物開發(fā)具有重要價值。

二、抗 CRV 單克隆抗體制備流程
（一）CRV 抗原制備與優(yōu)化

1. 病毒培養(yǎng)與純化

   • 細胞培養(yǎng)：選用 MA-104 細胞（恒河猴腎細胞），用含 1 μg/mL 胰酶的 MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) CRV（如 A79/10 株），37℃吸附 1 小時后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48-72 小時，收集含病毒的上清液。
   • 純化工藝： 
     • 超速離心法：上清液經(jīng) 4℃ 100,000×g 離心 2 小時，沉淀用 Tris-HCl 緩沖液重懸；
     • 蔗糖密度梯度離心（10%-40% 蔗糖）：進一步純化病毒顆粒，電鏡觀察確認完整病毒粒子（直徑約 70 nm，雙層衣殼結(jié)構(gòu)）。

2. 抗原組分篩選

   • VP4/VP7 蛋白表達：克隆 CRV VP4（47 kDa）和 VP7（38 kDa）基因，構(gòu)建至桿狀病毒 - 昆蟲細胞表達系統(tǒng)（Sf9 細胞），獲得具有天然構(gòu)象的重組蛋白（含糖基化修飾），通過 Ni 柱親和層析純化后，用 ELISA 篩選免疫原性強的組分（優(yōu)先選擇 VP7，因其為中和抗體主要靶點）。

（二）動物免疫與效價檢測

1. 免疫方案

   • 對象：6-8 周齡 Balb/c 小鼠（3-5 只），免疫前檢測血清背景（確保無 CRV 抗體）。
   • 程序：
     ① 初次免疫：腹腔注射純化 CRV 病毒（10? TCID??/ 只）或重組 VP7 蛋白（50 μg / 只）+ 弗氏完全佐劑；
     ② 加強免疫：每 2 周一次，共 3 次，使用弗氏不完全佐劑；
     ③ 末次免疫：融合前 3 天，靜脈注射無佐劑抗原（病毒或蛋白），刺激脾細胞活化。

2. 效價監(jiān)測

   • 末次免疫后 7 天，采集小鼠血清，以 CRV 病毒或 VP7 蛋白包被 ELISA 板（1 μg/mL），檢測抗體效價，選擇效價≥1:50,000 且能中和 CRV 感染的小鼠（中和試驗效價≥1:100）進行脾細胞提取。

（三）雜交瘤細胞構(gòu)建與篩選

1. 細胞融合

   • 取免疫小鼠脾臟制備單細胞懸液（1×10?個），與 SP2/0 骨髓瘤細胞按 5:1 比例混合，用 50% PEG 1500 誘導融合，接種于 HAT 培養(yǎng)基，7 天后換 HT 培養(yǎng)基篩選。

2. 克隆篩選與鑒定

   • 初篩（間接 ELISA）：以 CRV 病毒包被 96 孔板，篩選上清 OD 值≥陰性對照 2.1 倍的孔；
   • 復(fù)篩（中和試驗）：對初篩陽性孔培養(yǎng)上清進行病毒中和試驗（在 MA-104 細胞中測定抑制 50% CPE 的抗體稀釋度，中和效價≥1:200）；
   • 表位鑒定：采用 ELISA 競爭法，篩選識別不同 VP7 表位的抗體（如線性表位 vs 構(gòu)象表位），優(yōu)先保留構(gòu)象表位抗體（中和活性更強）；
   • 克隆化：有限稀釋法進行 3 次單克隆化，獲得穩(wěn)定分泌中和抗體的細胞株。

（四）抗體生產(chǎn)與純化

1. 腹水制備

   • 給 Balb/c 小鼠腹腔注射石蠟油預(yù)處理，7 天后接種雜交瘤細胞（1×10?個 / 只），7-10 天后收集腹水，4℃離心（3000 rpm，10 min），上清經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾。

2. 純化工藝

   • Protein G 親和層析：腹水通過 Protein G 柱純化 IgG 類抗體，洗脫液用 PBS 透析，超濾濃縮至 1-2 mg/mL；
   • 純度驗證：SDS-PAGE 檢測顯示單一 IgG 條帶，純度≥95%，Western blot 驗證其與 CRV VP7 蛋白的特異性結(jié)合。

（五）抗體功能鑒定

1. 中和活性測定

   • 空斑減少試驗（PRNT）：測定抗體抑制 CRV 在 MA-104 細胞中形成空斑的能力，計算中和效價（IC??），高活性抗體 IC??≤1 μg/mL；
   • 病毒吸附抑制試驗：檢測抗體是否阻斷 CRV 與細胞受體（如整合素 α?β?）的結(jié)合，驗證中和機制。

2. 特異性與交叉反應(yīng)

   • 種屬特異性：ELISA 檢測抗體與貓輪狀病毒（FRV）、豬輪狀病毒（PRV）的交叉反應(yīng)，要求交叉反應(yīng)率＜5%；
   • 病毒株覆蓋性：測試抗體對 CRV 不同亞型（如 G3、G5 型）的中和活性，篩選廣譜中和抗體。

三、關(guān)鍵技術(shù)難點與解決方案 難點 解決方案 CRV 培養(yǎng)滴度低 優(yōu)化培養(yǎng)條件：添加胰酶（激活 VP4 蛋白切割，增強感染性），使用低血清培養(yǎng)基（減少蛋白干擾） 中和表位篩選困難 構(gòu)建 VP7 蛋白突變體庫，通過點突變定位中和表位，優(yōu)先選擇保守區(qū)域（如 G-H 環(huán)）抗體 抗體依賴性增強（ADE）風險 篩選時排除與 Fc 受體結(jié)合的抗體（如通過 FcγR 結(jié)合試驗），避免 ADE 效應(yīng)（尤其用于治療時） 四、應(yīng)用場景

1. 臨床診斷

   • 膠體金層析試紙條：制備雙抗體夾心試紙條，檢測幼犬糞便中的 CRV 抗原，15 分鐘內(nèi)出結(jié)果，靈敏度達 10? TCID??/mL，符合 OIE 診斷標準；
   • RT-PCR 輔助檢測：抗體中和預(yù)處理樣本，區(qū)分活病毒與滅活病毒，提高核酸檢測的臨床意義。

2. 中和機制研究

   • 病毒 - 抗體共晶解析：通過 X 射線晶體學分析抗體與 VP7 的結(jié)合位點，指導廣譜中和抗體設(shè)計；
   • 病毒變異監(jiān)測：用抗體檢測 CRV 流行株的抗原漂移，輔助疫苗株更新（如 VP7 基因序列與抗體中和效價關(guān)聯(lián)分析）。

3. 治療與預(yù)防

   • 單克隆抗體療法：高中和活性抗體腹腔注射用于幼犬 CRV 感染治療，降低腹瀉發(fā)生率（動物實驗顯示保護率≥80%）；
   • 抗體 - 藥物偶聯(lián)物：將抗體與 RNA 聚合酶抑制劑偶聯(lián)，靶向遞送藥物至感染細胞，抑制病毒復(fù)制（臨床前研究階段）。

五、注意事項

1. 病毒培養(yǎng)安全：CRV 雖對人無致病性，但操作需在 BSL-2 實驗室進行，避免交叉污染；
2. 抗體亞型選擇：治療用抗體優(yōu)先選擇 IgG2a 亞型（小鼠來源），減少 FcγR 結(jié)合引發(fā)的 ADE 風險；
3. 批次穩(wěn)定性：腹水抗體需統(tǒng)一純化工藝，凍融 3 次后效價下降應(yīng)≤15%；
4. 診斷試劑標準化：建立 CRV 抗體標準品（如 WHO 參考血清），確保不同試劑盒結(jié)果可比。

抗 CRV 單克隆抗體的制備核心在于以 VP7 蛋白為靶點，結(jié)合中和試驗篩選高活性抗體，并通過表位分析提升其廣譜性。該類抗體不僅可用于 CRV 感染的快速診斷，還為幼犬輪狀病毒病的治療提供了新的生物制劑方向，具有重要的獸醫(yī)臨床價值。