一、犬腺病毒與單克隆抗體的研究背景

犬腺病毒（Canine Adenovirus, CAV）分為 CAV-1 和 CAV-2 兩種血清型：

• CAV-1：可引起犬傳染性肝炎（ICH），導(dǎo)致肝臟、腎臟等器官損傷；
• CAV-2：主要引起犬傳染性喉氣管炎（犬窩咳），常與其他呼吸道病毒（如犬副流感病毒、犬瘟熱病毒）協(xié)同感染。
  單克隆抗體（mAb）因其高特異性和均一性，在 CAV-1/2 的檢測、分型及致病機(jī)制研究中具有重要價(jià)值。

二、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的制備流程
1.  抗原制備

• CAV-1/2 抗原選擇： 
  • 病毒顆粒抗原：通過細(xì)胞培養(yǎng)（如犬腎細(xì)胞系 MDCK、A72 細(xì)胞）增殖病毒，經(jīng)滅活、純化后獲得全病毒抗原。
  • 特異性蛋白抗原：選擇 CAV-1/2 的結(jié)構(gòu)蛋白（如六鄰體蛋白 Hexon、纖維蛋白 Fiber）或非結(jié)構(gòu)蛋白，通過基因工程技術(shù)（如大腸桿菌 / 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)）制備重組抗原。
• 抗原純化：采用密度梯度離心（如 CsCl 離心）或?qū)游龇ㄈコ拗骷?xì)胞蛋白，確保抗原純度。

2.  免疫動(dòng)物與脾細(xì)胞獲取

• 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：常用 Balb/c 小鼠或大鼠，通過腹腔注射抗原（輔以弗氏佐劑），免疫 3-4 次（間隔 2-3 周），末次免疫后 3-5 天取脾臟分離脾細(xì)胞。
• 免疫策略：若需制備同時(shí)識別 CAV-1/2 的交叉反應(yīng)抗體，可使用混合抗原免疫；若需分型特異性抗體，需分別使用 CAV-1 和 CAV-2 抗原免疫。

3.  細(xì)胞融合與雜交瘤篩選

• 細(xì)胞融合：脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0、NS0）在 PEG 或電融合條件下融合，通過 HAT 培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。
• 篩選方法： 
  • 間接 ELISA：以 CAV-1/2 抗原包被板，篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
  • 中和試驗(yàn)（NT）：檢測抗體對病毒感染細(xì)胞的中和能力，篩選具有中和活性的單克隆抗體。
  • 免疫熒光（IFA）：驗(yàn)證抗體與病毒感染細(xì)胞的結(jié)合特異性，排除非特異性反應(yīng)。

4.  單克隆抗體的擴(kuò)增與純化

• 體內(nèi)擴(kuò)增：雜交瘤細(xì)胞注射至小鼠腹腔，收集腹水，通過 Protein A/G 親和層析或硫酸銨沉淀法純化抗體。
• 體外擴(kuò)增：無血清培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng)，結(jié)合層析技術(shù)純化，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

三、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的特異性與應(yīng)用
1.  特異性驗(yàn)證

• 型間交叉反應(yīng)：通過 ELISA/Western blot 檢測抗體與 CAV-1 和 CAV-2 的結(jié)合活性，區(qū)分： 
  • 型特異性抗體：僅識別 CAV-1 或 CAV-2 單一型別；
  • 交叉反應(yīng)抗體：同時(shí)識別 CAV-1 和 CAV-2（如針對保守抗原表位）。
• 中和活性驗(yàn)證：通過病毒中和試驗(yàn)確定抗體是否能阻斷病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，評估其潛在治療價(jià)值。

2.  主要應(yīng)用領(lǐng)域

• 病毒檢測與分型： 
  • ELISA / 膠體金試紙條：作為捕獲抗體或檢測抗體，用于犬血清、分泌物（如呼吸道拭子）中的 CAV-1/2 抗原檢測。例如，CAV-2 檢測試紙條可輔助診斷犬窩咳。
  • 免疫熒光（IFA）/ 免疫組化（IHC）：定位病毒在感染組織中的分布（如 CAV-1 感染的肝臟細(xì)胞），輔助病理診斷。
• 病毒中和機(jī)制研究：通過單克隆抗體識別的抗原表位，分析 CAV-1/2 的入侵機(jī)制（如纖維蛋白與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn)）。
• 治療性抗體開發(fā)：針對 CAV-1 引起的重癥肝炎，具有中和活性的單克隆抗體可作為被動(dòng)免疫制劑，與抗病毒藥物聯(lián)用提高療效。
• 疫苗研發(fā)工具：篩選能識別病毒保護(hù)性抗原表位的單克隆抗體，指導(dǎo)亞單位疫苗或基因工程疫苗的設(shè)計(jì)。

四、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的應(yīng)用案例
1.  CAV-1/2 分型檢測 ELISA

• 原理： 
  • 包被板分別固定 CAV-1 和 CAV-2 特異性抗原；
  • 待檢樣本中的抗體與抗原結(jié)合后，通過酶標(biāo)二抗顯色，根據(jù) OD 值判斷樣本中 CAV-1 或 CAV-2 抗體的類型及滴度。
• 優(yōu)勢：相比傳統(tǒng)血清學(xué)方法，單克隆抗體 ELISA 具有更高的特異性和重復(fù)性，可區(qū)分兩種血清型的感染。

2.  CAV-2 中和抗體的治療潛力

• 實(shí)驗(yàn)模型：建立 CAV-2 感染的犬類模型，注射特異性中和單克隆抗體，觀察其對呼吸道癥狀（如咳嗽、流涕）的緩解效果及病毒載量的下降趨勢。
• 應(yīng)用價(jià)值：對于免疫功能低下的幼犬，單克隆抗體可作為緊急干預(yù)手段，降低繼發(fā)細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。

五、局限性與發(fā)展方向
1.  局限性

• 病毒抗原變異：CAV-1/2 的結(jié)構(gòu)蛋白可能因基因突變導(dǎo)致抗原表位改變，影響單克隆抗體的結(jié)合效率。
• 生產(chǎn)成本與規(guī)模化：傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體周期長、成本高，需結(jié)合重組抗體技術(shù)（如噬菌體展示、酵母展示）優(yōu)化生產(chǎn)流程。

2.  發(fā)展方向

• 雙特異性抗體：設(shè)計(jì)同時(shí)識別 CAV-1 和 CAV-2 保守表位的雙特異性抗體，提高檢測或治療的廣譜性。
• 納米抗體（VHH）開發(fā)：從駱駝科動(dòng)物中篩選抗 CAV-1/2 的納米抗體，其分子量小、穩(wěn)定性高，更適合作為診斷探針或口服治療劑。
• 聯(lián)合檢測體系：將抗 CAV-1/2 單克隆抗體與抗犬瘟熱、犬細(xì)小病毒等抗體組合，開發(fā)多聯(lián)檢測試劑盒，滿足臨床快速篩查需求。