抗狂犬病毒（Rabies Virus, RV）N 蛋白和 G 蛋白的單克隆抗體（Monoclonal Antibodies, mAbs）在病毒檢測、疫苗評價及基礎研究中具有重要價值。以下從抗原特性、單抗制備、特異性優化及應用場景四個維度展開闡述：

一、RV N 蛋白與 G 蛋白的抗原特性
1.  N 蛋白（核衣殼蛋白）

• 結構與功能：
  N 蛋白是 RV 最保守的結構蛋白，包裹病毒 RNA 形成核衣殼，免疫原性極強，可誘導高效 IgG 抗體產生，但無中和活性。
• 抗原表位特點：
  含多個線性表位，對病毒株變異不敏感，是診斷檢測的理想靶點（如區分街毒株與疫苗株）。

2.  G 蛋白（糖蛋白）

• 結構與功能：
  G 蛋白是 RV 表面唯一的糖蛋白，以三聚體形式介導病毒與宿主細胞受體（如乙酰膽堿受體、nectin-1）結合及膜融合，是唯一能誘導中和抗體的抗原。
• 抗原表位特點：
  含 5 個抗原位點（I-V），其中位點 II 和 IV 為中和表位，易受病毒變異影響（如蝙蝠株 G 蛋白突變可能降低抗體結合效率）。

二、抗 RV N/G 蛋白單克隆抗體的制備技術
1.  傳統雜交瘤技術制備流程
（1）抗原制備

• N 蛋白：通過原核表達系統（如 E. coli）表達重組 N 蛋白（rN 蛋白），或使用滅活 RV 病毒顆粒（如 CVS 株）。
• G 蛋白：采用桿狀病毒 - 昆蟲細胞系統表達重組 G 蛋白（rG 蛋白），保留天然構象（含糖基化修飾），或使用病毒樣顆粒（VLPs）提升免疫原性。

（2）動物免疫與細胞融合

• 免疫方案：
  以 BALB/c 小鼠為宿主，腹腔注射抗原（rN/rG 蛋白 + 弗氏佐劑），共免疫 3-4 次，末次免疫后 3 天取脾臟 B 細胞與 SP2/0 骨髓瘤細胞融合。
• 篩選策略： 
  • N 蛋白單抗：通過間接 ELISA 篩選與 rN 蛋白結合強、與其他病毒（如犬瘟熱病毒）無交叉反應的克隆。
  • G 蛋白單抗：采用中和試驗（VNT）篩選能抑制 RV 感染 BHK-21 細胞的中和性單抗（結合位點 II/IV）。

（3）單克隆抗體純化與鑒定

• 采用 Protein A/G 親和層析純化腹水或細胞培養上清中的 IgG，通過 Western blot、ELISA 及中和試驗驗證特異性與功能。

2.  基因工程單克隆抗體制備

• 噬菌體展示技術：
  構建小鼠或人源抗體可變區（VH-VL）文庫，以 rN/rG 蛋白為靶點進行生物淘選，獲得重組單鏈抗體（scFv）或 Fab 片段，可在大腸桿菌中規模化生產。
• 人源化單克隆抗體：
  通過 CDR 移植技術將鼠源單抗的互補決定區（CDRs）嫁接到人源 IgG 框架上，降低免疫原性，適用于治療性抗體開發（如狂犬病被動免疫制劑）。

三、單克隆抗體的特異性優化策略
1.  針對 N 蛋白單抗的交叉反應控制

• 吸附去除法：
  將抗 N 蛋白單抗與犬副流感病毒、犬腺病毒等犬科動物病毒抗原共孵育，通過親和吸附去除非特異性抗體。
• 表位 mapPIng 篩選：
  合成 N 蛋白的多肽片段（如氨基酸殘基 100-200），篩選僅識別 RV N 蛋白特有表位的單抗（如與 rabies-related lyssaviruses 無交叉反應）。

2.  針對 G 蛋白單抗的中和表位強化

• 抗原構象優化：
  使用天然 G 蛋白（如病毒包膜純化的 G 蛋白）或 VLPs 免疫，誘導識別構象表位的中和性單抗，避免重組 G 蛋白線性表位的免疫偏差。
• 逃逸突變株篩選：
  通過 RV 與單抗共培養篩選逃逸突變株，反向驗證單抗的中和表位穩定性（如突變位點位于 G 蛋白受體結合域則提示表位易變異）。

四、單克隆抗體的應用場景
1.  病毒檢測與診斷
（1）N 蛋白單抗的應用

• 免疫熒光（IFA）：標記 FITC 或 Alexa Fluor 的抗 N 蛋白單抗，用于腦組織印片或細胞培養物中 RV 的快速檢測（金標準方法）。
• ELISA 檢測試劑盒：
  雙抗體夾心法（包被抗 N 單抗 + 生物素化抗 N 單抗），檢測血清 / 腦脊液中的 RV 抗原，靈敏度達 0.1 ng/mL。
• 膠體金試紙條：
  用于動物唾液、腦組織懸液中 RV 抗原的現場快速檢測（15 分鐘內出結果），適合狂犬病疫區野外篩查。

（2）G 蛋白單抗的應用

• 中和試驗（VNT）：
  基于抗 G 蛋白中和性單抗的病毒中和試驗（如快速熒光灶抑制試驗，RFFIT），用于評估疫苗誘導的中和抗體滴度（WHO 推薦疫苗效力檢測方法）。
• 病毒分型與進化分析：
  通過不同 G 蛋白單抗的結合譜，區分 RV 不同基因型（如基因 1 型至基因 7 型），輔助流行病學調查。

2.  疫苗研發與質量控制

• 疫苗效力評價：
  抗 G 蛋白中和性單抗可用于檢測疫苗免疫后動物血清的中和活性，替代傳統的動物攻毒試驗。
• 疫苗抗原純化：
  抗 N 蛋白單抗偶聯至親和層析柱，用于 RV 疫苗株（如 Vero 細胞培養的 Flury 株）的抗原純化，提升疫苗純度。

3.  治療性抗體開發

• 狂犬病被動免疫：
  人源化抗 G 蛋白中和性單抗（如 RB001）可替代馬源免疫血清或人狂犬病免疫球蛋白（HRIG），用于暴露后緊急預防，降低過敏風險。
• 中和機制研究：
  抗 G 蛋白單抗可阻斷病毒與宿主受體結合（如競爭抑制試驗），為抗病毒藥物設計提供靶點參考。

五、技術挑戰與前沿方向

1. 病毒變異的應對：
   蝙蝠源 RV 毒株的 G 蛋白存在高頻突變（如抗原位點 IV 的氨基酸替換），需開發針對跨基因型保守表位的廣譜中和性單抗。
2. 檢測技術的升級：
   結合微流控芯片技術，將抗 N/G 蛋白單抗集成于便攜式檢測平臺，實現唾液樣本中 RV 抗原的超敏檢測（檢測限達 102 TCID??/mL）。
3. 雙特異性抗體應用：
   設計同時靶向 N 蛋白（診斷）和 G 蛋白（中和）的雙特異性抗體，用于狂犬病的即時診斷 - 治療一體化策略。

總結

抗 RV N/G 蛋白單克隆抗體在狂犬病的診斷、預防及研究中扮演關鍵角色。N 蛋白單抗憑借高保守性成為檢測核心工具，而 G 蛋白單抗則通過中和活性推動治療性抗體與疫苗評價技術的發展。未來需結合基因工程技術與病毒進化研究，持續優化抗體的特異性與功能，為全球狂犬病防控提供更高效的分子工具。