光片熒光顯微術（LSFM）憑借高速三維成像和低光損傷特性，成為多細胞系統四維生物學成像的重要工具，但其光片厚度通常大于1微米，難以解析活細胞內亞微米級精細結構。本文聚焦瑞典皇家理工學院研究團隊開發的多片層可逆飽和光學熒光躍遷顯微術（Multi-sheet RESOLFT），該技術通過可逆光開關熒光蛋白（RSFPs）與周期性光開關圖案的結合，首次實現了亞100納米級光片厚度的超分辨斷層成像，并以1–2Hz的高速完成三維體積采集，為動態追蹤細胞分裂、肌動蛋白運動及病毒樣顆粒行為提供了全新視角。

重要發現者為Andreas Bodén、Ilaria TESTA等，研究成果以《Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy》為題，發表在《Nature Methods》雜志。

重要發現
01傳統光片成像的瓶頸與突破思路
傳統光片顯微術（如斜平面顯微鏡OPM）受光的衍射特性限制，即使采用高數值孔徑物鏡（NA~1.3），光片厚度也難以突破1–2微米，導致相鄰亞細胞結構（如間隔<1微米的細胞膜）在成像中嚴重模糊。為解決這一問題，研究團隊引入可逆飽和光學熒光躍遷（RESOLFT）原理，利用RSFPs的“開-關”雙穩態特性——通過405nm寬場光將所有熒光蛋白激活為“開”狀態，再以488nm正弦干涉圖案光（周期1.2微米，傾斜35°）精準關閉大部分區域的熒光，僅保留納米級厚度的發光片層。

02多片層并行化成像的核心機制
多片層RESOLFT的關鍵在于“光片印記-快速讀取”的創新流程：
光片印記：通過調節“關閉光”的功率和持續時間，可將發光片層厚度壓縮至100–200納米，較傳統OPM光片薄10倍以上（圖1b）。
快速讀取：使用488nm光片逐片激發印記的發光層，通過匹配光片間距與讀取光的艾里斑零強度點，避免相鄰層串擾。單次體積成像僅需10–20次熒光開關循環，顯著降低光漂白風險。

此外，該技術成功記錄了HeLa細胞4小時內的分裂全過程（圖5），以及病毒樣顆粒在細胞膜表面的動態聚集（圖6），展現了其在動態生物學研究中的強大潛力。

創新與亮點
01突破衍射極限的“納米級光片”
傳統光片成像的分辨率由光片厚度和檢測系統共同決定，而多片層RESOLFT通過光學調控熒光蛋白開關狀態，繞過了光的物理衍射限制。實驗顯示，其有效光片厚度可穩定控制在100–200納米，使三維體積分辨率達到250納米以下（x/y/z軸），首次在光片技術中實現了“超分辨斷層”能力。

03兼容性與多功能拓展
該技術對RSFPs的開關循環次數要求極低，可兼容rsEGFP2、rsEGFP(N205S)等多種熒光蛋白，并支持多色成像拓展。此外，其光學系統基于商用組件構建（僅衍射光柵需定制），兼容標準蓋玻片，為高通量活細胞成像奠定了基礎。

總結與展望
多片層RESOLFT顯微術通過光片技術與超分辨原理的跨維度融合，突破了傳統光學成像在分辨率、速度與光損傷之間的固有矛盾，為解析亞細胞結構的時空動態提供了革命性工具。當前技術已實現140×84×15微米3體積的高速成像，未來通過升級激光器功率和相機靈敏度，有望將采集速度提升至0.5秒/體積以下，并進一步拓展至更大樣本（如類器官）和更深組織（需結合像差校正技術）。

在應用層面，該技術可廣泛用于腫瘤細胞遷移機制、病毒組裝路徑、細胞器互作網絡等前沿領域，甚至為實時監測藥物對亞細胞結構的動態影響提供可能。隨著RSFPs光譜多樣性的提升和自動化算法的優化，多片層RESOLFT或將推動光片成像從“宏觀觀察”邁向“納米級動態解析”，成為連接分子生物學與細胞生物學的關鍵橋梁。

正如研究團隊在討論中指出，這項技術不僅是光學成像的一次技術突破，更預示著“智能光片”時代的到來——通過動態調控光開關圖案與熒光蛋白行為，未來的光片顯微鏡或將實現分辨率、速度與成像深度的按需切換，為生命科學研究帶來無限想象空間。

DOI:10.1038/s41592-024-02196-8.