蛋白質結晶成像
生物晶體明確且可靠的鑒定仍然是晶體學研究的一個主要障礙，特別是在實驗初步篩選的關鍵階段。在可見范圍內的高分辨率自動成像往往不足以識別所有產生或可能產生晶體的條件。

晶體學家經常依靠芳香族氨基酸的固有熒光，如色氨酸，來區分鹽晶和蛋白質晶體。紫外熒光成像檢測色氨酸的熒光，并在許多情況下產生高對比度的圖像，有助于表征結晶液滴。在某些情況下，蛋白質含有很少的色氨酸氨基酸，或者根本沒有，無法使用紫外熒光成像。在蛋白質中添加熒光分子，可以在很短的成像時間內獲得高對比度的圖像，且樣品沒有損傷。

蛋白質的染料標記
有許多方法標記蛋白質與熒光染料，范圍從非常簡單沒有純化步驟的實驗方案，到利用利用色譜柱去除多余的染料等涉及更多步驟的方法。一種簡單的方法是將琥珀酰亞胺酯染料在DMSO中溶解，然后將其直接添加到自己的蛋白質溶液中，等待5分鐘，然后照常分配蛋白質。Formulatrix成像儀在檢測熒光時非常靈敏，因此只需要標記0.1%的總蛋白即可。

在向蛋白質中添加染料時，重要的是要使用不包含競爭性反應性胺且pH值為7至8的緩沖液。據觀察，在等待 5分鐘后，當標記率低于所有賴氨酸的1%時，超過80%的染料已經被標記到蛋白質上，這使得從溶液中去除多余的染料不是必要的。比率大于1％的標記將導致反應性酯的不完全水解，并導致溶液中過量的未結合染料在成像時產生強烈的熒光背景。0.1％至0.3％的標記足以用Formulatrix成像儀生成高對比度圖像。標記率的提高只會降低圖像質量和/或需要純化以去除過量的染料。當pH值非常低或非常高時，會極大影響標記效率，導致標記完全失敗。當pH值約為6.5可能會導致蛋白質氨基末端的選擇性標記。最佳的pH值范圍在7.0至8.4 之間，這將有助于達到預期的結果。

通常來說，利用小分子修飾蛋白質的想法是會令人不安的，會引起是否對結晶和構象產生負面影響的擔憂。這里描述的方案和例子是0.1%的可用賴氨酸被標記的蛋白質，結果對其余99.9%的蛋白質影響很小。話雖如此，這也不是一個完全受控的過程，可以想象標記蛋白的構象會受到不同染料附著位置的影響。值得注意的是，這是賴氨酸與染料結合的一個相對隨機的過程，其構象會發生變化，但與99.9%未標記的蛋白質相比，仍在統計學上并不相關。晶體學是一種平均技術，其最終結構是晶體中每個分子的平均。

因此，0.1%蛋白質的異常將被平均掉，而不會影響最終的整體晶體結構。

此外，衍射質量的晶體是由非常均勻的蛋白質分子組成的。這意味著，如果標記影響了蛋白質的結構/構象，被標記的蛋白質將不會率先進入晶體。反之亦然，如果標記的蛋白質最終處于衍射晶體中，其構象將與未標記的蛋白質幾乎相同，而不會對晶體結構產生不利影響。這是預期的結果，也是該技術所依賴的。

多熒光成像
Formulatrix成像儀提供了對三種不同波長的結晶板進行自動成像的功能。這使得科學家可以利用紫外通道和其他兩種可見光波段的固有熒光。光學器件設計用于紫外和可見熒光成像，每個通道都有單獨的光源，以提高靈敏度。當對結晶板成像時，濾鏡立方體會自動切換，并且可以完全自定義使用目標染料（圖1）。

圖1. 具有3個完全可定制的濾光器模塊自動切換的多 熒光光學路徑。

蛋白質-蛋白質復合物檢測通過多熒光成像得以簡化。一個人操作就可以簡單地用不同的熒光團標記每個蛋白質，圖像上都有可見的熒光通道，只要發現熒光重疊，就可以知道這兩種蛋白質都存在于晶體中（圖2）。

圖2. 蛋白A-蛋白B復合物晶體，其中蛋白A標記為texas red，蛋白B標記為熒光素。

熒光染料的選擇和影響
可以根據所使用的蛋白質、pH值范圍和成本來選擇染料。同樣重要的是，確保如果使用兩個不同的染料有最小光譜重疊。通常來說，所有的N-羥基琥珀酰亞胺酯綴合染料在水溶性條件下都是有效的標記。熒光素和texas red是兩種便宜的染料，在光譜上是分離的，并能產生良好的結果。然而，它們確實表現出了對pH依賴性，熒光素對pH小于7.0特別敏感，pKa為6.4（圖3），因此在各種蛋白酶抑制劑CocktAIl的條件下篩選并不理想。Alexa 488和Alexa 594是兩種光譜分離染料的好選擇，在各種條件下都能很好地工作， 并且在pH4和10之間沒有pH依賴性。

圖3.熒光素的pH依賴性光譜：A）吸收光譜，B）發射光譜。

膜蛋白的標記
膜蛋白的標記不像可溶性蛋白那么容易。對于膜蛋白來說，可能無法獲得大量的賴氨酸殘基，這使得難以確定要添加的正確染料量。而且，大多數熒光染料包含高度疏水的芳族環，該芳族環通過與帶電基團連接而變得水溶性。因此，許多染料會分解成疏水性去污劑微團或微細胞，導致溶液中的有效濃度發生變化，未反應染料的濃度變高。Cherezov在他的FRAP 分析方法論文中解釋了一個標記膜蛋白的有用例子。

用可見熒光屏蔽
使用熒光染料提高了靈敏度，因此在篩選時更容易找到晶體。例如，與周圍的沉淀物相比，由于小晶體中蛋白質的濃度較高，因此可以區分掩埋在沉淀物下的小晶體（圖4）。使用高倍物鏡也可以看到高分辨率小晶體。大范圍的變焦值允許液滴自動定位，然后以更高的穩定性成像。還可以以更高的分辨率查詢自定義的感興趣區域，以產生更精細的細節和對比度（圖5）。

圖4.小的蛋白質晶體在可見的熒光圖像中可視化，否則在傳統的明場圖像中將看不到。

圖5. Formulatrix成像儀中的大視野范圍使液滴可以自動成像，
并且可以定義感興趣的自定義區域以產生更高分辨率的圖像。

結論
多種成像技術可用于篩選蛋白質結晶板，包括可見光、雙折射光、紫外熒光和可見熒光成像。用小分子熒光團標記很小百分比的蛋白質的能力使人們可以檢測高蛋白質濃度的區域。染料標記的蛋白質發出的熒光可以很容易地區分蛋白質和鹽晶，也可以找到隱藏在沉淀物下的小晶體。當處理蛋白質-蛋白質復合物時，它也是一個很好的工具。人們可以簡單地使用不同染料標記每個蛋白質，然后成像，以查看它們在哪里發現熒光的共定位。這樣就可以確定晶體是否同時包含兩種蛋白質，且無需進行XRD表征。0.1％的標記率對晶體質量和蛋白質結構輸出幾乎沒有影響，使其成為一種非侵入性方法。

0.1%標記示例-溶菌酶

1. 在DMSO中溶解染料，形成5mM的原液

2. 用溶菌酶的MW常數為14.7kDa (147000 g/ mol)，可以將20 mg/ml溶菌酶溶液轉化為1.36 mM

3. 假設對氨基殘基的標記效率為1:1，并利用溶菌酶有6個賴氨酸，100%標記所有活性位點等于8.16 mM

4. 如果只需要標記0.1%的位點，則染料的添加濃度應為8.16μM

5. 在250μL的20mg/ml溶菌酶溶液中加入0.4μL 5mM染料，蛋白標記率為0.1%