原代細胞培養純化是細胞生物學研究中的關鍵步驟，旨在從組織中分離并獲得高純度的特定細胞類型，為后續實驗提供可靠的材料。原代細胞培養純化的作用原理主要圍繞抑制非目標細胞生長、促進目標細胞選擇性增殖。

原代細胞培養純化需結合實驗目的和細胞類型選擇合適的方法。操作過程中需嚴格無菌、優化消化條件、檢測細胞活性，并監控污染。通過綜合運用多種方法，可獲得高純度、高活性的原代細胞，為后續實驗提供可靠材料。

我們在介紹原代細胞純化前需要了解原代培養的概念，因為很多小伙伴很容易分不清原代培養與原代細胞的概念：

原代培養（primary culture），通俗地講，就是第一次培養。它是指將培養物放置在體外生長環境中持續培養，中途不分割培養物的培養過程。
 

1.  原代培養的實質是初次培養，即培養物一經接種到培養皿中就不再分割，任其生長繁殖而不更換培養器皿；

2.  原代培養中的『代』并不是指細胞的『代』數； 

3.  原代培養過程中不分割培養物不等于不更換培養基；

4.  植塊培養不一定都是原代培養，植塊培養有時候在培養物增長到一定程度后，也需要移植培養物到新的器皿再培養。

原代細胞（primary culture cell）是指從機體取出后立即培養的細胞。有人把培養的第1代細胞與傳10代以內的細胞統稱為原代細胞。

原代細胞培養純化的主要方法：

1、機械分離法

◆原理：利用物理方法（如切割、刮除）分離目標細胞。

◆應用：適用于組織塊較大、細胞分布不均的情況，如從器官中分離特定區域細胞；適用于多種類型細胞明顯成片區生長，區域細胞純度較高。

◆操作：在顯微鏡下手動分離目標組織區域，避免混入其他細胞類型；在顯微鏡下觀察，用記號筆在細胞培養瓶上勾畫出雜細胞的分布區域，然后用細胞刮刀伸入瓶內，刮除雜細胞，保留目標細胞（常用于成纖維細胞和上皮細胞交錯成塊分布）。

√ 優點：操作簡單，成本低。

× 缺點：對細胞機械損傷較大，分離效果可能不如酶消化法。

2、酶消化法

◆原理：使用胰蛋白酶、膠原酶等酶類消化組織，如膠原酶，特異性降解纖維化組織的膠原蛋白、消化腫瘤組織塊，破壞來自間質的成纖維細胞，可獲得較純的癌細胞；中性蛋白酶，切割細胞外基質中的纖連蛋白和層粘連蛋白，釋放單細胞。

◆應用：廣泛用于貼壁細胞（如成纖維細胞、上皮細胞），適用于纖維化組織（如胰腺、肝臟）、腫瘤組織、上皮細胞和內皮細胞的分離。

◆操作：將組織剪碎后，加入適量酶液消化，通過控制消化時間和溫度，使目標細胞脫離組織，

同時避免消化過度。

√ 優點：分離效率高，細胞活性好。

× 缺點：酶的成本較高，消化時間及效果難以控制，且可能對某些細胞類型有毒性。

3、差速貼壁分離法

◆原理：利用不同種類細胞貼壁速度差異性及細胞敏感性不同，通過控制培養時間差或消化時間差，可選擇性移除未貼壁或弱貼壁的細胞，從而分離目標細胞。

◆應用：成纖維細胞對胰蛋白酶作用敏感，組織塊或消化傳代時，成纖維細胞常常先脫落；原代細胞懸液接種后，成纖維細胞貼壁速度比上皮細胞、心肌細胞快。

◆操作：將剛從組織分散的細胞懸液接種于培養皿內，于37℃，5%CO2恒溫培養箱中靜置培養，0.5-2h后，吸取未貼壁細胞懸液，一般先貼壁細胞為成纖維類細胞，未貼壁懸液多為上皮類細胞。

√ 優點：無需特殊試劑，操作簡單。

× 缺點：分離周期長，純度可能有限。

4、化學試劑抑制法

◆原理：利用增殖期細胞的作用敏感性，通過抑制雜細胞增殖，從而避免少量雜細胞成為優勢細胞，拉大目的細胞與雜細胞優劣勢差而分離目標細胞。

有些化學物質對成纖維細胞的生長有抑制作用，而對培養的目標細胞無明顯影響。因此，在細胞貼壁生長或分裂后，利用這些化學物質抑制成纖維細胞生長，從而獲得純度較高的目標細胞。

 如阿糖胞苷通過抑制細胞DNA的合成，干擾細胞的增殖；嘌呤霉素作為蛋白合成抑制劑，能抑制細胞的生長。

◆應用：阿糖胞苷在神經元、心肌等不增殖細胞；嘌呤霉素在微血管內皮細胞等貼壁增殖緩慢的細胞純化作用。

◆操作：將剛從組織分離出來的神經元細胞懸液接種于培養皿內，同時加入合適濃度的藥物篩選，于37℃，5%CO2恒溫培養箱中靜置培養，藥物作用2-5d后更換新鮮培養基。

√ 優點：操作簡便，成本較低，特定細胞類型效果明顯，可與其他方法聯合使用。

× 缺點：細胞損傷風險較高，純化效果有限，過程不可控，批次差異大，結果不穩定，可能影響細胞功能。

5、密度梯度離心法

◆原理：利用不同細胞類型的密度差異，通過離心分層。

◆應用：適用于血液細胞等單細胞懸液（如淋巴細胞、單核細胞）的分離。

◆操作：將細胞懸液疊加于密度梯度介質（如Ficoll）上，離心后不同細胞層分布在不同介質層中，收集目標細胞層。

 

 

√ 優點：分離純度高，適用范圍廣。

× 缺點：離心時間長，對操作技能要求較高。

6、免疫磁珠分選法

◆原理：利用特異性抗體標記目標細胞，通過磁場分離。

◆應用：高純度分離特定細胞亞群（如CD4+ T細胞、干細胞）。

◆操作：將細胞與磁珠標記的抗體孵育，通過磁場分離標記細胞，未標記細胞被去除。

√ 優點：分離純度高，可達99%以上。

× 缺點：設備昂貴，操作復雜，成本較高。

7、流式細胞術分選法

◆原理：利用熒光標記抗體，通過流式細胞儀識別并分離目標細胞。

◆應用：高精度、高純度分離細胞亞群（如腫瘤干細胞、免疫細胞）。

◆操作：將細胞與熒光標記抗體孵育，通過流式細胞儀分析并分選目標細胞。

√ 優點：分離效率高，細胞活性好、純度高，分析參數多、數據全面。

× 缺點：儀器價格昂貴，操作技術門檻高，細胞容易損傷。

8、專用培養基及相關因子組合篩選法

◆原理：原代細胞的培養成功高度依賴于專用培養基和關鍵生長因子的優化組合；不同細胞類型對營養成分（如葡萄糖、氨基酸）、激素（如胰島素）、細胞因子（如EGF、bFGF）的需求各異；因此需要系統篩選和優化培養體系來模擬目的細胞體內微環境（如膠原蛋白、層粘連蛋白），促進細胞貼附、增殖或分化。

信號通路調控生長因子：通過激活特定通路（如EGF→EGFR→MAPK）促進增殖或分化；劑量依賴性：低濃度可能無效，高濃度可能誘導異常分化（如TGF-β在腫瘤中的作用）

◆應用：廣泛用于原代細胞篩選。如神經元細胞：添加B27維持神經特性；干細胞：添加bFGF維持干性；腫瘤細胞：提供高糖和谷氨酰胺支持瓦氏效應（Warburg effect）；血管內皮細胞：需要包被培養皿，促進細胞貼附、增殖，添加VEGF促進血管分化。

◆操作：依據細胞增殖分化特性及信號通路需求，選擇合適基礎培養基，添加相關生長因子，定制專用完全培養基。

 

√ 優點：提高細胞存活率，減少批次變異，適用于臨床級細胞實驗，精準控制細胞代謝行為。

× 缺點：研發配制價格昂貴，測試驗證周期長，因子添加劑價格昂貴。
 

在實際操作中，剛分離出的原代細胞往往純度較低，且雜細胞種類多；后期接種培養時，需要根據目的細胞及雜細胞的特性和實時狀態，運用多種純化方法結合去培養純化，才能達到高純度、高活性的目的原代細胞。