抗豬流行性腹瀉病毒 N 蛋白（PEDV-N）單克隆抗體解析 一、PEDV-N 蛋白特性與抗原優(yōu)勢 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒科，其 N（核衣殼）蛋白是病毒最保守的結(jié)構(gòu)蛋白，具有以下特點： 結(jié)構(gòu)特征： 分子量約 46 kDa，由 415-432 個氨基酸組成，富含精氨酸和賴氨酸，親水性強。 含多個抗原表位，包括線性表位（如氨基酸殘基 100-150、200-250）和構(gòu)象表位，免疫原性高。 抗原優(yōu)勢： 保守性：不同 PEDV 毒株（如經(jīng)典株 CV777、變異株 AJ1102）的 N 蛋白氨基酸同源性＞95%，顯著高于 S 蛋白（同源性約 80%），適合制備廣譜抗體。 穩(wěn)定性：N 蛋白不參與病毒與宿主細胞的結(jié)合，不易因免疫壓力發(fā)生突變，抗體識別表位更穩(wěn)定。 二、PEDV-N 單克隆抗體制備關(guān)鍵流程 1. 抗原制備與免疫策略 重組 N 蛋白表達： 載體選擇：常用 pET 系列原核表達載體（如 pET-28a），在 BL21 (DE3) 大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，或使用桿狀病毒 - 昆蟲細胞系統(tǒng)（真核表達，更接近天然構(gòu)象）。 純化方法：Ni-NTA 親和層析純化，純度需≥95%（SDS-PAGE 驗證），抗原濃度調(diào)整至 1 mg/mL 用于免疫。 動物免疫： 模型：6-8 周齡 BALB/c 小鼠，腹腔注射重組 N 蛋白（50 μg / 次）+ 弗氏完全佐劑（首次），后續(xù)用不完全佐劑加強免疫 3-4 次，間隔 2 周。 免疫監(jiān)測：末次免疫后 7 天采血，ELISA 檢測血清抗體效價，需≥1:10?方可進行細胞融合。 2. 雜交瘤制備與篩選 細胞融合： 免疫小鼠脾細胞與 SP2/0 骨髓瘤細胞按 5:1 比例混合，PEG1500 誘導(dǎo)融合，HAT 培養(yǎng)基篩選 7-10 天。 陽性克隆篩選： 雙抗體夾心 ELISA：包被重組 N 蛋白，檢測雜交瘤培養(yǎng)上清中的抗體，篩選 OD 值＞2.1 倍陰性對照的克隆。 Western blot 驗證：用 PEDV 感染的 Vero 細胞裂解液檢測抗體與天然 N 蛋白的結(jié)合活性。 毒株交叉反應(yīng)性測試：用經(jīng)典株（CV777）和變異株（AJ1102、DR13）的 N 蛋白驗證抗體廣譜性。 3. 單克隆化與抗體生產(chǎn) 有限稀釋法：將陽性雜交瘤細胞稀釋至 0.5 細胞 / 孔，克隆化培養(yǎng) 2-3 輪，確保單克隆性。 抗體生產(chǎn)： 腹水制備：小鼠腹腔注射降植烷（0.5 mL / 只）預(yù)處理，7 天后注射雜交瘤細胞（1×10?/ 只），7-10 天收集腹水，抗體濃度可達 5-10 mg/mL。 細胞培養(yǎng)：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，離心后通過 Protein A/G 親和層析純化，抗體純度＞98%。 三、PEDV-N 單克隆抗體特異性參數(shù) 1. 抗原識別特性 表位定位： 通過肽段掃描（Peptide scanning）確定表位，常見高免疫原性區(qū)域包括： 氨基酸殘基 120-135（線性表位，經(jīng)典株與變異株高度保守）； 殘基 280-300（含 α- 螺旋結(jié)構(gòu)，構(gòu)象表位，部分抗體依賴此區(qū)域結(jié)合）。 交叉反應(yīng)性： 對 PEDV 各基因型（如 G1a、G2a、G2b）毒株的 N 蛋白結(jié)合率＞95%，對豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、TGEV 等無交叉反應(yīng)（ELISA 驗證）。 2. 功能活性參數(shù) 親和力（KD 值）： 高親和力抗體 KD 值＜10?? M（BLI 或 SPR 檢測），典型值為 10?1?-10?11 M，確保檢測靈敏度。 應(yīng)用場景活性： 診斷：適用于雙抗體夾心 ELISA（檢測限可達 1 ng/mL PEDV 抗原）、免疫熒光（IFA）、膠體金試紙條（檢測時間＜15 分鐘）。 中和活性：N 蛋白抗體無病毒中和能力（因 N 蛋白不參與病毒入侵），中和抗體需針對 S 蛋白。 3. 穩(wěn)定性與效期 保存條件：純化抗體用 PBS（pH 7.4）稀釋至 1 mg/mL，添加 0.02% 疊氮鈉，4℃保存 6 個月活性≥90%，-20℃可長期保存。 批間一致性：不同批次抗體 ELISA 效價差異≤10%（CV 值＜10%），需通過 3 次獨立制備驗證。 四、PEDV-N 抗體的應(yīng)用場景與優(yōu)勢 應(yīng)用類型 技術(shù)要點 優(yōu)勢 病原檢測 - ELISA：包被抗體（10 μg/mL）+ 檢測抗體（5 μg/mL），標準曲線范圍 0.1-100 ng/mL - 膠體金試紙條：T 線包被 N 抗體，C 線包被羊抗鼠 IgG 對變異株檢測靈敏度高，不受 S 蛋白突變影響，適合流行病暴發(fā)期的快速篩查。 病毒定量 熒光定量 PCR 聯(lián)合 N 抗體免疫捕獲（RT-PCR-IP），提高低載量樣本檢出率（檢測限降至 102 拷貝 /mL） 結(jié)合分子與免疫技術(shù)，減少核酸檢測假陰性。 疫苗評估 檢測免疫動物血清中的 N 抗體水平，評估疫苗免疫原性（如滅活疫苗誘導(dǎo)的 N 抗體效價≥1:103） N 抗體效價與病毒載量呈正相關(guān)，可作為疫苗保護力的輔助指標。 基礎(chǔ)研究 免疫共沉淀（Co-IP）分析 N 蛋白與宿主蛋白（如 RIG-I、MDA5）的相互作用，或用于病毒樣顆粒（VLP）組裝研究 高特異性抗體可精準識別天然 N 蛋白的結(jié)合伴侶。 五、制備與應(yīng)用注意事項 抗原構(gòu)象影響：真核表達的 N 蛋白（如昆蟲細胞表達）比原核表達的包涵體蛋白更易誘導(dǎo)構(gòu)象表位抗體，建議優(yōu)先選擇真核表達系統(tǒng)。 檢測方法優(yōu)化：ELISA 檢測時需注意 N 蛋白的包被濃度（最佳 5-10 μg/mL）和封閉條件（5% 脫脂奶粉優(yōu)于 BSA），避免非特異性結(jié)合。 生物安全：使用 PEDV 活病毒進行 IFA 或中和試驗時，需在 BSL-2 實驗室操作，滅活病毒需驗證失活（56℃ 30 分鐘 + 核酸酶處理）。 如需開發(fā)針對 PEDV 的治療性抗體，需結(jié)合 S 蛋白抗體（中和活性）與 N 蛋白抗體（檢測輔助），形成聯(lián)合檢測或治療方案。